吳偉全，李元歌，唐金鳳，王思捷，楊騰，吳平

（廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，廣東 湛江 524001）

普通熒光顯微鏡和普通共聚焦顯微鏡系統(tǒng)能采集生物組織樣本的熒光圖像[1-4]，但它們都沒有超分辨成像功能，不可以獲取超分辨率熒光圖像。隨著顯微鏡系統(tǒng)的不斷發(fā)展，出現(xiàn)新型的超分辨率共聚焦系統(tǒng)，具有超分辨率圖像重構(gòu)(Super-Resolution Image Reconstruction，SR)與 CI 反卷積（Constrained Iterative Deconvolution）成像新技術(shù)，但由于超分辨率圖像重構(gòu)及CI 反卷積成像技術(shù)處于起步階段，類似研究罕見，因此需進(jìn)一步探索其使用價(jià)值。 本實(shí)驗(yàn)擬用超分辨率圖像重構(gòu)共聚焦成像技術(shù)對(duì)蒿草樣本的熒光圖像進(jìn)行采集，并使用其軟件cellSens 的CI 反卷積功能處理圖像，分析超分辨率圖像重構(gòu)與CI 反卷積共聚焦成像技術(shù)檢測生物組織樣本超分辨率熒光圖像的使用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和相關(guān)樣本 DMI3000B 熒光倒置顯微鏡（德國萊卡公司）；TCS SP5 II 共聚焦顯微鏡系統(tǒng)（德國萊卡公司）；新型FV3000 共聚焦顯微鏡系統(tǒng)（日本奧林巴斯公司），配有OSR 超分辨圖像重構(gòu)及CI 反卷積模塊。蒿草樣本（德國萊卡公司），為DAPI、FITC 及TRITC 熒光染色后固定在載玻片上。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)不同顯微鏡類型及成像技術(shù)分為四組:1 組:熒光倒置顯微鏡采集蒿草樣本熒光圖像；2 組: 普通共聚焦系統(tǒng)采集蒿草樣本熒光圖像；3 組: 新型共聚焦系統(tǒng)超分辨率圖像重構(gòu)技術(shù)采集蒿草樣本超分辨率熒光圖像；4 組: 新型共聚焦系統(tǒng)CI 反卷積功能處理蒿草樣本超分辨率熒光圖像。 每組重復(fù)3 次。

1.2 熒光倒置顯微鏡采集蒿草樣本熒光圖像 使用德國Leica DMI3000B 熒光倒置顯微鏡， 分別用紫外光、 藍(lán)光和綠光為激發(fā)光激發(fā)DAPI、FITC 及TRITC 三染色的蒿草樣本，物鏡為40 倍鏡，采集熒光圖像。

1.3 普通共聚焦系統(tǒng)采集蒿草樣本共聚焦熒光圖像 使用德國Leica TCS SP5 II 共聚焦顯微鏡系統(tǒng)，分別用 405nm、488nm 和 543nm 波長激發(fā) DAPI、FITC 及 TRITC 三染色的蒿草樣本， 物鏡為 40 倍鏡，采集共聚焦熒光圖像。

1.4 新型共聚焦系統(tǒng)超分辨率圖像重構(gòu)成像采集蒿草樣本的超分辨率熒光圖像 使用新型日本奧林巴斯 FV3000 共聚焦顯微鏡系統(tǒng)， 分別用405nm、488nm 和 561nm 波長激發(fā) DAPI、FITC 及TRITC 三染色的蒿草樣本，物鏡為60 倍油鏡，采集超分辨熒光圖像。

1.5 新型共聚焦系統(tǒng)CI 反卷積功能處理蒿草樣本的超分辨率熒光圖像 新型日本奧林巴斯FV3000共聚焦系統(tǒng)采集超分辨率熒光圖像后， 啟動(dòng)軟件cellSens 的CI 反卷積功能，處理蒿草樣本超分辨率熒光圖像，獲得相關(guān)樣本的超分辨率反卷積圖像。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 各組熒光圖像熒光強(qiáng)度值由軟件LAS X3.0 采集，數(shù)據(jù)資料經(jīng)SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)值用±s 表示。數(shù)據(jù)分析用方差分析，多樣本均數(shù)比較選用 LSD 法、Dunnett 法。 P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光倒置顯微鏡采集的蒿草樣本熒光圖像蒿草樣本經(jīng)DMI3000B 熒光倒置顯微鏡采圖，DAPI染色為藍(lán)色的熒光圖像；FITC 染色為綠色的熒光圖像；TRITC 染色為紅色的熒光圖像; 另外可得三色疊加的熒光圖像（見圖1A、1B、1C 和 1D）。 DAPI染色熒光圖像熒光值為31.40±0.09；FITC 染色熒光圖像熒光值為15.47±0.25；TRITC 染色熒光圖像熒光值為 40.93±0.02。 見表1。

圖1 DMI3000B 熒光倒置顯微鏡采集的蒿草樣本熒光圖像(400×)

2.2 普通共聚焦系統(tǒng)采集的蒿草樣本共聚焦熒光圖像 蒿草樣本經(jīng)TCS SP5 II 共聚焦顯微鏡系統(tǒng)采圖，DAPI 染色為藍(lán)色的共聚焦熒光圖像；FITC染色為綠色的共聚焦熒光圖像；TRITC 染色為紅色的共聚焦熒光圖像;另外可得三色疊加的共聚焦熒光圖像；與熒光倒置顯微鏡組（1 組）的比較，相同倍數(shù)共聚焦熒光圖像圖像清晰度高，可以清晰顯示蒿草樣本切片的整體切面結(jié)構(gòu)（見圖2A、2B、2C 和2D）。 DAPI 染色熒光圖像熒光值為 39.49±1.23；FITC 染色熒光圖像熒光值為 20.65±0.13；TRITC染色熒光圖像熒光值為47.58±0.15；相同倍數(shù)不同染料染色熒光圖像熒光強(qiáng)度分別與熒光倒置顯微鏡組（1 組）的比較，熒光圖像更亮，熒光值增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 見表1。

2.3 新型共聚焦系統(tǒng)超分辨率圖像重構(gòu)采集的蒿草樣本超分辨率熒光圖像 蒿草樣本經(jīng)FV3000 共聚焦顯微鏡系統(tǒng)超分辨率圖像重構(gòu)采圖，DAPI 染色為藍(lán)色的超分辨率熒光圖像；FITC 染色為綠色的超分辨率熒光圖像；TRITC 染色為紅色的超分辨率熒光圖像;另外可得三色疊加的超分辨率熒光圖像；與普通共聚焦系統(tǒng)組（2 組）的比較，可以獲取高倍數(shù)的蒿草樣本超分辨率熒光圖像 （見圖3A、3B、3C 和 3D）。DAPI 染色熒光圖像熒光值為 7.11±0.02；FITC 染色熒光圖像熒光值為 14.11±0.09；TRITC 染色熒光圖像熒光值為 13.12±0.10。 見表1。

圖2 TCS SP5 II 共聚焦顯微鏡系統(tǒng)采集的蒿草樣本共聚焦熒光圖像（400×）

2.4 新型共聚焦系統(tǒng)CI 反卷積功能處理的蒿草樣本超分辨率反卷積圖像 新型FV3000 共聚焦系統(tǒng)采集超分辨率熒光圖像后，再使用軟件cellSens 的CI 反卷積功能處理，分別獲得其超分辨率反卷積圖像（見圖4A、4B、4C 和 4D）。 與新型共聚焦系統(tǒng)超分辨率圖像重構(gòu)技術(shù)組（3 組）的比較，可更清晰觀察到蒿草樣本切片的細(xì)微結(jié)構(gòu)（見圖4D 中箭頭指示部分）。 DAPI 染色熒光圖像熒光值為17.35±0.23；FITC 染色熒光圖像熒光值為 15.86±0.07；TRITC 染色熒光圖像熒光值為16.09±0.24；相同倍數(shù)不同染料染色超分辨率反卷積圖像熒光強(qiáng)度分別與新型共聚焦系統(tǒng)超分辨率圖像重構(gòu)技術(shù)組（3組）的比較，圖像更亮，熒光值增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 見表1。

圖3 新型FV3000 共聚焦系統(tǒng)超分辨率圖像重構(gòu)采集的蒿草樣本超分辨率熒光圖像（3000×）

3 討論

熒光（fluorescence）是指利用一定波長的光致發(fā)光的發(fā)光現(xiàn)象[5]。 熒光顯微鏡是生物組織樣本熒光成像的重要儀器，可以采集生物組織樣本熒光圖像，但由于是普通光源，獲取熒光圖像效果一般，有一定局限性[6，7]。本實(shí)驗(yàn)的熒光圖像結(jié)果也體現(xiàn)了這個(gè)局限性。

共聚焦顯微鏡系統(tǒng)是使用激光光源結(jié)合共聚焦技術(shù)一種顯微鏡，得到的共聚焦熒光圖像克服了熒光顯微鏡熒光圖像效果不佳的缺點(diǎn)，因而其熒光圖像效果較好[8-10]。 與熒光倒置顯微鏡的熒光圖像比較，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示相同倍數(shù)共聚焦熒光圖像圖像清晰度更高，可以清晰顯示蒿草樣本切片的整體切面結(jié)構(gòu)，熒光圖像更亮，熒光值增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明共聚焦熒光圖像效果更好，與相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果類似。

近年新型的共聚焦系統(tǒng)推出超分辨率成像功能，使用超分辨率圖像重構(gòu)成像新技術(shù)[11]。 超分辨率圖像重構(gòu)是指通過硬件結(jié)合軟件方法，采集分析一系列低分辨率的圖像來得到一幅高分辨率的圖像過程，其是提高成像系統(tǒng)分辨率的一類技術(shù)[12，13]。CI 反卷積技術(shù)是一種圖像處理及圖像恢復(fù)的新技術(shù)，通過使用專業(yè)限制迭代算法，對(duì)于提高圖像的分辨率非常有效[14，15]。 本實(shí)驗(yàn)顯示新型的超分辨率共聚焦系統(tǒng)可以準(zhǔn)確獲取超分辨率圖像，與普通共聚焦系統(tǒng)相比，可獲取高倍數(shù)的蒿草樣本超分辨率熒光圖像。 使用軟件cellSens 的CI 反卷積功能處理，可獲得超分辨率反卷積圖像，與新型共聚焦系統(tǒng)超分辨率圖像比較，圖像更亮，熒光值增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可更清晰觀察到蒿草樣本切片的細(xì)微結(jié)構(gòu)。

圖4 新型FV3000 共聚焦系統(tǒng)CI 反卷積獲取的蒿草切片超分辨率反卷積圖像（3000×）

表1 四組蒿草樣本不同染料染色熒光圖像熒光強(qiáng)度比較

本實(shí)驗(yàn)采用樣本截面結(jié)構(gòu)清晰的蒿草樣本[16]，使用超分辨率圖像重構(gòu)與CI 反卷積共聚焦成像技術(shù)對(duì)蒿草樣本的熒光成像進(jìn)行分析研究，結(jié)果表明超分辨率圖像重構(gòu)與CI 反卷積共聚焦成像技術(shù)檢測生物組織樣本，采集超分辨率熒光圖像具有較高的使用價(jià)值。