郭萍，劉洋，魏丹丹，萬(wàn)臘根

（南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006）

侵襲性肺曲霉菌病 (Invasive Pulmonary Aspergillosis，IPA)的發(fā)病率近些年來(lái)呈現(xiàn)出逐年上升的態(tài)勢(shì)，其主要與目前大量廣譜抗菌藥物、腫瘤化療藥物、 器官移植術(shù)后的免疫抑制劑及糖皮質(zhì)激素等廣泛使用有關(guān)，已經(jīng)逐漸成為影響患者生命安全的重要感染疾病[1]。 過往關(guān)于IPA 診斷相關(guān)研究多集中于血液病患者，尤其是粒細(xì)胞缺乏患者[2]。隨著IPA 感染的逐漸播散，越來(lái)越多的診斷手段及相關(guān)指南中診斷標(biāo)準(zhǔn)的普及推廣，IPA 感染在非粒細(xì)胞缺乏患者中同樣存在高發(fā)，且多不像粒細(xì)胞缺乏患者癥狀典型，故常因不能及時(shí)有效的診斷而死亡率較高[3]。 傳統(tǒng)診斷方法主要以影像學(xué)檢查、痰涂片、痰培養(yǎng)及血清GM 試驗(yàn)等手段，但這些技術(shù)手段在粒細(xì)胞缺乏患者上存在一定的敏感性和特異性，而在非粒細(xì)胞缺乏患者IPA 的診斷上存在較大的偏差性，造成了IPA 早期診斷困難，嚴(yán)重影響IPA 患者的預(yù)后[4]。

隨著人口的老齡化，COPD 患者已逐漸成為了社會(huì)中的主要群體部分。 而COPD 并發(fā)的IPA 感染則直接影響老年人的生命安全。 半乳甘露聚糖（galactomannan，GM） 是存在于曲霉菌細(xì)胞壁表面的多糖抗原成分，可在早期感染釋放入血液及其他體液標(biāo)本中，可持續(xù)存在1～8 周[5]，因此，其常被看做是早期診斷IPA 感染的有效手段，但隨著研究的深入，我們發(fā)現(xiàn)血清GM 檢測(cè)常受到患者的細(xì)胞免疫，尤其是中性粒細(xì)胞免疫的限制，導(dǎo)致其在非粒細(xì)胞缺乏患者IPA 診斷價(jià)值十分有限。 支氣管肺泡灌洗液（BALF）是利用纖維支氣管鏡，對(duì)肺段和亞肺段進(jìn)行灌洗后，采集肺泡表面襯液所得。 而已有大量研究及IPA 感染診治共識(shí)表明，BALF-GM檢測(cè)對(duì)IPA 診斷具備較大的診斷價(jià)值，卻缺乏可靠的實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)準(zhǔn)，因此GM 試驗(yàn)在IPA 感染的診斷價(jià)值及其Cutoff 值的設(shè)定尚無(wú)定論。在COPD 患者并發(fā)IPA 感染診斷中的價(jià)值更無(wú)明確的研究，對(duì)其造成的假陽(yáng)性和假陰性的影響因素也報(bào)道較少[6]。 因此本研究通過收集我院非粒細(xì)胞缺乏CO PD 患者的疑似 IPA 患者 BALF GM 試驗(yàn)值， 探討B(tài)ALF-GM 試驗(yàn)對(duì)非粒細(xì)胞缺乏患者并發(fā)IPA 的診斷價(jià)值，并對(duì)其造成的假陽(yáng)性和假陰性的影響因素進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取 2016 年 1 月至 2017 年 1 月在南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的疑似IPA COPD 患者59 例，排除了粒細(xì)胞缺乏、慢性肺曲霉病患者，進(jìn)行BALF-GM 試驗(yàn)，并收集患者完整的臨床病例資料。 基于臨床及病理診斷，對(duì)59 例患者根據(jù)中國(guó)肺真菌病診斷和治療專家共識(shí)分為IPA 組和非 IPA 組。 IPA 組 11 例，其中確診 3 例，臨床診斷 8 例，非 IPA 組 48 例。 見圖1。

圖1 研究流程圖：患者的篩選和記錄

1.2 研究方法

1.2.1 IPA 的診斷 IPA 診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2007 年我國(guó)的肺真菌病診斷和治療專家共識(shí)及血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌病的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則 （第四次修訂版）[7]，分為確診、臨床診斷和擬診。 確診：同時(shí)具備危險(xiǎn)因素、臨床特征、微生物學(xué)證據(jù)及組織病理學(xué)證據(jù)；臨床診斷：符合危險(xiǎn)因素、臨床特征及微生物學(xué)證據(jù)， 包括特異性抗原檢測(cè)陽(yáng)性或合格的痰標(biāo)本連續(xù)≥2 次分離到曲霉菌； 擬診：具備危險(xiǎn)因素和臨床特征，但無(wú)微生物學(xué)證據(jù)者。 由于部分患者過早預(yù)防性使用抗真菌藥物治療，存在一定假陰性可能， 故本文我們將臨床診斷與擬診IPA 合并為一組。

1.2.2 GM 試驗(yàn) 采用固相夾心法 ELISA 按照Platelia Aspergillus 試劑盒 (美國(guó) Bio-Rad 公司產(chǎn)品)說(shuō)明操作，分別將標(biāo)準(zhǔn)液、陽(yáng)性對(duì)照液、陰性對(duì)照液及待測(cè)液各 300μl 和 100μl 處理液混勻，100℃水浴 3 分鐘，10000rpm/min 離心 10min， 取上清50μl 加入 96 孔板中，每孔中加入結(jié)合液 50μl 后，封板37℃水浴90min，洗板5 次后，加入顯色液200 μl，室溫避光 30min 后加入終止液 100μl。 放置酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)處讀取各孔的吸光度（OD）值。通過以下公式計(jì)算 GM 值：GM 值=OD 待測(cè)液/OD 標(biāo)準(zhǔn)液。

1.2.3 假陽(yáng)性和假陰性的干擾因素 參照文獻(xiàn)方法[8]，對(duì)臨床資料回顧性分析，篩選出引起GM 檢測(cè)假陽(yáng)性和假陰性的可能干擾因素。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0 軟件，計(jì)量資料以±s 表示，采用T 檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以百分比表示，采用卡方檢驗(yàn)或Fisher 精確檢驗(yàn)。 IPA 組和非IPA 組的血清GM 檢測(cè)值均為非正態(tài)分布，采用 Man-Whitney 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)算BALF-GM 實(shí)驗(yàn)的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值。 選擇ROC 曲線下面積比較BALF-GM 試驗(yàn)的不同臨界值，探索最佳臨界值。

2 結(jié)果

2.1 患者情況臨床特征及GM 結(jié)果分析 本研究中11 例IPA 患者及48 例非IPA 患者臨床特征如表1 所示。 在IPA 組中，肺部基礎(chǔ)疾病如肺癌、支氣管擴(kuò)張及肺結(jié)核等，肺外基礎(chǔ)疾病如糖尿病、高血壓、慢性肝炎及肝硬化、風(fēng)濕性疾病及實(shí)體器官腫瘤等及激素治療均與非IPA 組無(wú)顯著性差異。

表1 非粒細(xì)胞缺乏IPA 患者和非IPA 患者的臨床特征及基礎(chǔ)疾病

按宿主因素、臨床特征、微生物學(xué)及組織病理學(xué)檢查情況分類發(fā)現(xiàn)，IPA 組中確診患者共3 例（27.27%），GM 值中位數(shù)為 1.32（0.75～3.64）；臨床診斷+擬診患者 8 例 （72.73%），GM 值中位數(shù)為1.395（0.9～12.4）；非 IPA 患者 48 例，GM 值中位數(shù)為 0.65（0.50～3.94）。 其中確診組與臨床診斷+擬診組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。臨床診斷+擬診組與非IPA 組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

BALF 標(biāo)本下的GM 檢測(cè)最佳陽(yáng)性界值 GM試驗(yàn)不同臨界值的靈敏度、 特異度、PPV、NPV、AUC 及約登指數(shù)見表2。 其中臨界值為0.88 時(shí)對(duì)應(yīng)的約登指數(shù)最高，故設(shè)其為BALF-GM 試驗(yàn)最佳臨界值。

由表2 及特征性ROC 曲線圖3 可知，BALFGM 試驗(yàn)的最佳截?cái)嘀禐?.8，敏感性和特異性分別為90.91%和85.42%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為55.56%和97.56%。 ROC 曲線下面積為0.882（標(biāo)準(zhǔn)誤差，0.036，95%置信區(qū)間 0.826～0.977），約登指數(shù)為0.763。

圖2 BALF-GM 實(shí)驗(yàn)的受試者工作特征曲線

2.3 BALF 標(biāo)本GM 實(shí)驗(yàn)假陽(yáng)性和假陰性影響因素分析 以0.88 作為GM 實(shí)驗(yàn)的最佳陽(yáng)性界值，陽(yáng)性患者共 18 例，假陽(yáng)性 8 例，真陽(yáng)性 10 例。 陰性患者共41 例，假陰性 1 例，真陰性 40 例。

在8 例假陽(yáng)性患者中，2 例患者由隱球菌感染引起，3 例患者因使用半合成類青霉素引起，1 例假陰性結(jié)果因檢測(cè)前使用了抗真菌藥物伏立康唑造成。

3 討論

BALF 即支氣管肺泡灌洗液，是向支氣管肺泡內(nèi)注人生理鹽水并隨即吸出，收集肺泡表面的有效液體，其常作為臨床侵入性肺部疾病診斷的有效手段。 侵襲性肺曲霉菌感染因其感染隱匿、進(jìn)展快、難抑制和高死亡率等特點(diǎn)受到臨床重視[9]。 目前針對(duì)IPA 感染的診斷多主要集中于粒細(xì)胞缺乏感染患者的診斷，而在非粒細(xì)胞缺乏患者的診斷上尚存在較大的不足。 目前傳統(tǒng)檢測(cè)方法如痰培養(yǎng)、痰涂片及影像學(xué)檢查等面臨諸耗時(shí)長(zhǎng)、敏感性差、特異性差等諸多缺點(diǎn)，而血清學(xué)檢測(cè)手段BALF-GM 試驗(yàn)因其直接反映感染病灶而具備較高的特異性與敏感性被廣泛使用，尤其是在粒細(xì)胞缺乏患者并發(fā)IPA 上的診斷價(jià)值已被廣泛認(rèn)可[10]，并已納入了粒細(xì)胞缺乏患者的IPA 診斷微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，然而其在非粒細(xì)胞缺乏COPD 患者并發(fā)IPA 的診斷中仍有較大爭(zhēng)議[11]。

表2 BALF-GM 試驗(yàn)不同臨界值的檢測(cè)結(jié)果

血清GM 試驗(yàn)因其曲霉菌侵襲血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)才釋放入血液，常因細(xì)胞免疫而臨床使用受限，且容易因臨床藥物的使用及其他菌種的交叉感染而影響結(jié)果[12，13]。 相較而言，BLAF-GM 試驗(yàn)對(duì) I PA 診斷價(jià)值的報(bào)道越來(lái)越多，Meersseman 等[14]研究提示以BALF GM 吸光度指數(shù)＞0.5 為閾值，診斷敏感度為88%，特異度為87%。 Shin 等[15]研究也提示BALF GM 敏感度為85%。 本研究結(jié)果顯示，BALF GM 實(shí)驗(yàn)的臨界值為0.88 時(shí)，敏感性為90.91%，特異性為85.42%，約登指數(shù)最大，提示BALF GM 實(shí)驗(yàn)以0.88 為臨界值時(shí)具有最佳臨床應(yīng)用價(jià)值。 此時(shí)敏感度及特異度較高，ROC 曲線下面積為0.882。 本研究結(jié)果顯示非粒細(xì)胞缺乏COPD 患者并發(fā)IPA 多發(fā)生在具有支氣管炎、 陳舊性肺結(jié)核等肺部基礎(chǔ)疾病，部分也存在激素治療史，但與非IPA 感染患者無(wú)明顯差異，表明BALF-GM 試驗(yàn)診斷價(jià)值不受肺部基礎(chǔ)疾病的影響。 此外，在肺外基礎(chǔ)疾病如糖尿病、高血壓、慢性肝炎及肝硬化、風(fēng)濕性疾病及實(shí)體器官腫瘤等兩組也無(wú)顯著性差異，表明BALF-GM 試驗(yàn)對(duì)COPD 患者IPA 感染具備較高的診斷價(jià)值。

以0.88 為臨界值， 對(duì)其中的8 例假陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在假陽(yáng)性結(jié)果中分為感染性因素和非感染性干擾因素，感染性因素由隱球菌交叉反應(yīng)引起，非感染性因素由使用半合成青霉素復(fù)合制劑引起，因此臨床上在面對(duì)假陽(yáng)性結(jié)果時(shí)可從感染與非感染角度進(jìn)行分析，以提高GM 值在COPD 患者IPA 感染鑒別診斷的應(yīng)用價(jià)值。而1 例假陰性患者在檢測(cè)前使用了抗真菌藥物且有輸血史，GM 值明顯低于臨界值，但由于本次研究數(shù)據(jù)較少，差異不明顯，此結(jié)論需擴(kuò)大數(shù)據(jù)范圍再作分析。

綜上所述，本研究選擇BALF-GM 值為0.88 作為非粒細(xì)胞缺乏COPD 患者并發(fā)IPA 感染診斷的最佳臨界值，ROC 曲線下面積最大，具有最佳臨床應(yīng)用價(jià)值，在此診斷條件下，GM 實(shí)驗(yàn)假陽(yáng)性多由感染性干擾因素和非感染性干擾因素引起， 對(duì)其區(qū)分有助于臨床診斷。