豆曉霞 莘海亮 張森 王俊峰 侯秀發(fā)

[摘要][目的]構(gòu)建布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)蛋白BMEII 0735基因的原核表達載體，進行表達、鑒定。[方法]本研究從羊種布魯氏菌（B.melitensis） 043株的基因組中克隆BMEII 0735基因片段，亞克隆到pMD 19-T載體中，并測序，克隆至表達載體pET-28 a，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a -BMEII 0735，利用大腸桿菌進行表達，并進行Western-Blot檢測。[結(jié)果]成功構(gòu)建了pET-28a-BMEII 0735原核表達栽體，并在大腸桿菌中成功表達了BMEII 0735基因。經(jīng)過SDS-PAGE檢測，重組蛋白的分子量大約是64 KDa。經(jīng)Western-Blot檢測，BMEII 0735蛋白可與布魯氏菌的陽性血清發(fā)生特異性反應，表明其具有良好的反應原性。[結(jié)論]本實驗成功表達了布魯氏茵IV型分泌系統(tǒng)蛋白BMEII 0735基因，并成功獲得了BMEII 0735蛋白。BMEII 0735蛋白具有與布魯氏菌自身蛋白相同的抗原性，為進一步研究布魯氏菌病的鑒別診斷以及其免疫原性和保護性奠定了基礎。

[關鍵詞]布魯氏菌;BMEII 0735;鑒定;原核表達;反應原性

[中圖分類號] S852.61

[文獻標識碼]A

由布魯氏菌（Brucella）所引起的一種人和多種動物共患的傳染病，稱為布魯氏菌病，簡稱為布病，又稱為波浪熱或馬爾他熱。該病的傳染源主要是患病動物和隱性患畜（包括野生動物），其中在布病流行病學上最為重要寄生為羊、豬和牛。羊在國內(nèi)為主要傳染源，其次為豬和牛。該病的病原——布魯氏菌，是一種小球桿狀菌，細胞內(nèi)寄生，革蘭氏染色陰性，沒有鞭毛，不形成芽孢，專性需氧菌，主要寄生在巨噬細胞和胚胎滋養(yǎng)層細胞內(nèi)，對外界環(huán)境抵抗力較強，在不同的介質(zhì)里面可長期穩(wěn)定存活，如在水中可生存5天-4個月，在塵埃里可存活21-72天，在鮮牛乳中可存活18個月之久，在土壤和糞尿中可生存5月有余，但布魯氏菌對濕熱、紫外線、常用消毒劑等比較敏感。布魯氏菌病感染主要特征為人表現(xiàn)多汗、長期發(fā)熱、肌肉和關節(jié)疼痛及肝、脾腫大等;母畜表現(xiàn)為生殖器官和胎膜發(fā)炎、流產(chǎn)、不育等;公畜表現(xiàn)為睪丸炎、附睪炎等，嚴重影響?zhàn)B殖業(yè)的經(jīng)濟發(fā)展和公共衛(wèi)生健康?，F(xiàn)下，能有效預防和控制布魯氏菌病傳播的疫苗還沒有研制出來，也沒有能夠使得該病徹底康復的有效措施。就全世界范圍而言，布魯氏菌病廣泛流行于很多國家，南美洲、地中海地區(qū)和亞洲等地是布魯氏菌病的高發(fā)區(qū)。在中國，布魯氏菌病波及全國大多數(shù)范圍，自20世紀初，在我國重慶地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)布魯氏菌病以來，現(xiàn)已在全國絕大多數(shù)省、市區(qū)存在程度不一的流行，特別是北方農(nóng)牧區(qū)，例如新疆、河南、內(nèi)蒙古、東北三省等地，被《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定為二類疫病。并且隨著畜牧業(yè)的發(fā)展以及近些年布病的流行趨勢，世界范圍內(nèi)的布病的人畜疫情均出現(xiàn)了回升趨勢，并且日趨嚴重。新疆等西部地區(qū)布魯氏菌病動物的感染率為15%左右，有些養(yǎng)殖場的發(fā)病率為40%以上。布魯氏菌侵染宿主細胞涉及黏附、侵入、轉(zhuǎn)運、傳播及復制多個復雜過程。大量研究表明，布魯氏菌的分泌蛋白能夠使機體獲得有效的免疫應答，可作為候選靶標進行布魯氏菌病的診斷性抗原的篩選和亞單位疫苗的研制。細菌的分泌蛋白有著良好的橋梁作用，使得細菌和機體之間進行互相作用，被認為是最有潛力的保護性抗原。布魯氏菌大多數(shù)的分泌蛋白，在侵入宿主細胞的過程中都有著重要的作用，但是其具體的分子作用機制，目前還不清楚。有結(jié)果顯示，布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)蛋白在布魯氏菌侵入宿主細胞的過程中起著重要的作用，能夠使機體受到刺激，產(chǎn)生較好的免疫應答。因為其具有該特點，布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)蛋白在布病的鑒別診斷和有效的疫苗研制中有著非常重要的作用和研究價值。本研究選取羊布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)蛋白BMEII 0735基因作為研究對象，構(gòu)建BMEII 0735基因的原核表達載體，通過Western-Blot檢測其反應原性，為進行布魯氏菌的保護性抗原分子篩選、疫苗免疫與布魯氏菌鑒別診斷靶點的研究等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細菌和載體

石河子大學動物科技學院，動物疾病防控重點實驗室提供布魯氏菌羊種043株、菌株E.coli DH 5 a、pET-28 a載體菌株、BL21（DE 3）菌株;Promega公司購買pMD 19-T載體。

1.2 主要試劑

石河子大學動物科技學院/動物疾病防控重點實驗室保存的布魯氏菌羊種陽性血清;Merck公司購買誘導劑IPTG;由大連寶生物工程有限公司提供限制性內(nèi)切酶（BamH I/Xho I）、T4連接酶和DNA marker;細菌質(zhì)粒小提取試劑盒以及瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限責任公司;蛋白Marker、HRP標記的兔抗羊IgG、購自北京康為世紀生物科技有限責任公司;BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購自生工生物工程（上海）有限股份公司;剩余試劑均為本實驗室常用分析純度的產(chǎn)品。

1.3 目的基因擴增

登錄GeneBank，查找布魯氏菌（NC-003317）BMEII 0735的基因序列，設計引物，由北京六合華大基因有限公司進行合成，序列見表1。

布魯氏菌羊種043分離株的滅活菌液（90℃金屬浴滅活30min）做為模板，進行菌液PCR擴增，PCR反應體系（20 uL）見表2，反應條件見表3。反應結(jié)束后，PCR產(chǎn)物直接進行1%瓊脂糖凝膠凝膠電泳或4℃保存?；厥漳康幕蚱危⑴c載體pMD19-T在16℃水浴條件下進行連接，連接體系（10 uL）見表4，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD 19-T-BMEII 0735。再將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli DH 5 α感受態(tài)細胞，在氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上進行陽性篩選，進行菌液PCR和雙酶切鑒定陽性克隆，并將提取的質(zhì)粒送往上海生物工程技術服務有限公司進行測序。

1.4 構(gòu)建BME110735基因原核表達載體

將測序正確的pMD 19-T- BMEII 0735質(zhì)粒和pET-28 a載體用BamH I和Xho I限制性內(nèi)切酶進行雙酶切處理，目的片段和酶切后的線性pET-28 a載體用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行回收。將線性pET-28 a載體和目的片段，在16℃水浴條件下用T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli BL 21（DE 3）感受態(tài)細胞，經(jīng)LB固體培養(yǎng)基（卡那抗性）篩選陽性克隆，進行菌液PCR驗證和酶切鑒定。

1.5 重組蛋白表達及表達條件的優(yōu)化

將篩選出的陽性克隆菌置于LB液體培養(yǎng)基中，200r/min、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，將過夜培養(yǎng)的菌液按1：100的比例，接種至新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，200r/min、37℃繼續(xù)培養(yǎng)1h左右，使其OD值為0.4-0.6，在其他條件不變的情況下，按照不同的誘導劑（IPTG）濃度（終濃度為0.2mM，0.6mM，1.0mM）、誘導不同時間（0h，4h，6h，8h），收集菌體。取1ml菌液2000r/min離心后，棄掉上清，并在離心管中按照1：4的比例加入稀釋后的1×SDS蛋白上樣緩沖液，在振蕩器上震蕩，使菌體和蛋白上樣液充分混勻，在金屬加熱器上100℃加熱10 min，取20ul樣品進行15%蛋白電泳。觀察電泳結(jié)果。篩選目的基因的最佳表達條件，并以最佳的誘導表達條件，進行蛋白大量誘導表達，并采用AKTA蛋白純化系統(tǒng)進行蛋白純化，進行SDS-PAGE電泳鑒定。

1.6 重組蛋白的Western-Blot檢測

篩選出蛋白的最佳表達條件后，以最佳誘導條件誘導重組蛋白表達，并對重組蛋白進行純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將重組蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，以200mA的電流轉(zhuǎn)膜1h。再將NC膜放入雜交瓶（預先用TBST緩沖液洗滌）中。37℃封閉2h，NC膜用TBST緩沖液洗滌3次，每次7 min。加入1：500比例稀釋的經(jīng)石河子大學動物疾病防控兵團重點實驗室鑒定的布魯氏菌羊種陽性血清，37℃孵育2h，NC膜用TBST緩沖液洗滌3次，每次7min，然后加入1：5000比例稀釋的辣根過氧化氫酶標記的兔抗綿羊IgG，37℃孵育2h，NC膜用TBST緩沖液洗滌3次，每次7min。避光條件下，DAB顯色劑進行顯色后拍照。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴增及酶切鑒定

NCBI中記錄的羊種布魯氏菌BMEII0735基因的片段大小為1578 bp，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析后，與實際的大小一致，如圖l所示。用相應的（ BamH I/Xho I）限制性內(nèi)切酶進行雙酶切后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。結(jié)果顯示，得到大小與預期結(jié)果相符合的基因條帶。表明羊種布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)蛋白BMEI10735基因已經(jīng)成功插入pET-28 a表達載體中，如圖2所示。

2.2 重組蛋白表達條件的優(yōu)化

為探尋重組蛋白表達的最佳誘導劑濃度和誘導時間，分別在誘導時間不變的前提下，設置誘導劑濃度梯度，篩選最佳誘導劑濃度;在誘導劑濃度不變的前提下，設置時間梯度篩選最佳誘導時間。結(jié)果顯示，在誘導劑IPTG的終濃度為1 mmol/L誘導8h條件下，重組蛋白表達量最高，如圖3所示。重組蛋白大量誘導表達后，經(jīng)AKTA蛋白純化系統(tǒng)進行蛋白純化。SDS-PACE分析表明，純化后的蛋白條帶清晰，無雜帶，顯示純化效果較好，結(jié)果如圖4所示。

2.3 Westem-Blot檢測

將誘導8h后的重組蛋白純化后，進行Western-Blot檢測，200mA恒流電流下轉(zhuǎn)膜1h，可見明顯的陽性條帶。結(jié)果表明，誘導得到的重組蛋白能被HRP標記的兔抗綿羊IgG抗體識別，且大小與pET-28分子質(zhì)量加上目標分子蛋白質(zhì)量的重組蛋白總分子質(zhì)量相符，結(jié)果如圖5所示。

3 討論

在我國，將布魯氏菌病列為職業(yè)病。2019年，布魯氏菌病又被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列為畜牧業(yè)強制免疫的傳染病之一，可見布病的危害影響。防控布魯氏菌病的關鍵在于疫苗免疫和檢疫凈化。目前，國內(nèi)市面上現(xiàn)有的布病疫苗雖然有一定的免疫效果，但其免疫效果并未達到我們所期望的高度，重點是不能區(qū)分布魯氏菌野毒感染和疫苗免疫，為布病的檢疫凈化帶來重重困難。

自2002年羊種布魯氏菌16M參考基因組測序工作完成以來，已經(jīng)有300多株布魯氏菌基因組完成了測序，其中有16株基因組已經(jīng)進行了精細的物理圖譜繪制。目前，隨著部分布魯氏菌菌株的基因組序列測序的完成，使我們在分子層面研究布魯氏菌的致病機理有了進一步的提高和發(fā)展?？傊剪斒暇c易感動物群之間的相互作用是一個非常復雜的過程。本文通過構(gòu)建布魯氏菌BMEI10735基因的原核表達載體并對其反應原性進行鑒定，有助于進一步了解布魯氏菌蛋白質(zhì)的功能，為布魯氏菌的鑒別診斷研究和生物信息學分析提供參考，為進一步探究布魯氏菌的分子致病機制以及布魯氏菌的鑒別診斷奠定了基礎。

[參考文獻]

[1]徐麗，劉松財，張永亮.蛋白質(zhì)組學的研究進展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2007（22）.

[2]孫志華，劉良波，張豫等，布魯氏菌外膜蛋白VirB4在感染胚胎滋養(yǎng)層細胞中的作用分析[J].中國人獸共患病學報，2014（10）.

[3]宮曉煒，周繼章，布魯菌外膜蛋白OMPIO表達及其抗原性的研究[J].動物醫(yī)學進展，2009（12）.

[4] Abdalla A，Hamid M E.Comparison of conventional and non-conventional techniques for the diagnosis of hovine brucellosis inSudan[J]. TROPICAL ANIMAL HEALTH AND PRODUCTION， 2012（06）.

[5]紀太旺，張輝，郭飛，等，布魯氏菌043強毒株BR0524基因缺失突變株的構(gòu)建與毒力的初步評價[J].石河子大學學報（自科版），2014（05）.

[6]張豫，張輝，張艷，等布魯氏菌磷酸葡萄糖變位酶基因的原核表達與鑒定[J].石河子大學學報（自科版），2013（01）.

[7] Ruchi Shrivastava. Jeff F Miller. Virulence Factor Secretion hy BordetellaSpecies[J]. Current Opinion in Microbiology，2009（01）.

[8] Kokoglu O F，Hosoglu S，Ceyik M F，et al. Clinical and laboratoryfeatures of brucellosis in two university hospitals in Southeast Turkey.[J].Tropical Doctor， 2006（ 01）.

[9]趙天靖，賈曉曉，焦寒偉，等，布魯氏菌外膜蛋白2基因的克隆、原核表達及蛋白生物信息學分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2014（09）.

[10]邢進，王金鋒，趙寶華，布魯菌病及其診斷方法研究進展[J].動物醫(yī)學進展.2009（03）.

[11]趙曉燕，朱亮，姜德玉，等.布魯菌BMEI1829基因的原核表達、蛋白純化及動物免疫試驗[J].動物醫(yī)學進展，2010（10）.

[12] Cassataro J， Estein SM， Pasquevich KA， et a/. Vaccination with theRecombinant Outer Membrane Protein 31 0r a Derived 27-Amino-Acid Synthetic Peptide Elicits a CD4T Helper l Response That Protectsagainst Infection[J]. Infection and immunity，2005（ 12）.

[13]趙巖，李明，胡福泉.細菌的IV型分泌系統(tǒng)[J].生命的化學，2011（01）.

[14]丁家波，毛開榮，程君生，等.布氏桿菌病疫苗的應用和研究現(xiàn)狀[J].微生物學報，2006（05）.

[15]Wattam AR， Williams KP， Snyder EE， et a/. Analysis of Ten BrucellaCenomes Reveals Evidence for Horizontal Gene Transfer Despite aPreferred Intracellular Lifestyle[J]. Journal of Bacteriology. 2009（11）.