鄭麗麗，張玲，黃荳，羅琳，李偉，馮旭輝

（江西省婦幼保健院藥劑科，南昌330006）

雌激素水平參與了學(xué)習(xí)、 記憶等腦功能的調(diào)節(jié)。 女性絕經(jīng)后雌激素的缺乏可引起記憶力和認知功能的衰減，增加了阿爾茨海默?。ˋD）的發(fā)病風(fēng)險。 中藥在改善認知、改善學(xué)習(xí)記憶障礙方面的研究受到了越來越多的關(guān)注[2]。 茯苓（poria cocos）為多孔菌科真菌茯苓[poria cocos (schw)wolf]的干燥菌核。 目前對于含有茯苓的復(fù)合物改善學(xué)習(xí)記憶方面作用的研究逐漸增多， 但茯苓單藥的作用效果及可能作用機制卻鮮有報道。 因此本研究通過去卵巢大鼠建立低雌激素記憶障礙模型 （戊酸雌二醇組為陽性對照組），觀察茯苓對去卵巢大鼠在Morris 水迷宮中空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響，并觀察各組動物腦中與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)的BDNF、TrkB 蛋白表達水平的變化， 探討茯苓改善絕經(jīng)后婦女認知功能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6-8 個月齡SPF 級雌性SD 大鼠，體質(zhì)量180-200g， 由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2014-0001， 于江西省精神病院實驗動物中心飼養(yǎng)。

1.2 藥物及試劑 茯苓 （中國食品藥品檢定研究院，批號：121117-201910）；戊酸雌二醇片（拜耳藥業(yè)，批號：455A）；0.9%氯化鈉溶液（江西通達藥業(yè)，批 號：1903143301）；BDNF、pTrkB、TrkB、actin 抗體：購自Santa cruz 公司。

1.3 模型制作 大鼠禁食24 h， 禁水8 h， 用10%水合氯醛（3ml·kg-1）進行麻醉，打開腹腔對雙側(cè)卵巢進行切除。假手術(shù)組僅切除卵巢周邊部分脂肪組織，縫合腹壁，禁食24 h。

1.4 分組與給藥 將60 只實驗大鼠隨機分為為模型組、假手術(shù)組、戊酸雌二醇（0.8mg/kg）、茯苓低、中、高 劑 量 組（0.3g/kg、0.6g/kg、1.2g/kg），每 組10只。 模型組和假手術(shù)組灌胃0.9%氯化鈉溶液10 ml·/kg，每日給藥1 次，連續(xù)5 周。

1.5 Morris 水迷宮實驗 水溫為19℃-20℃，水池包括I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4 個象限。 定位航行實驗：將水下平臺置于某一象限（在訓(xùn)練的5d 中位置固定不變）。大鼠分別從4 個不同象限面對池壁放入水中，找到平臺后，記錄逃避潛伏期，如果大鼠在60s 內(nèi)未找到平臺，逃避潛伏期標記為60s。 5d 的定位航行實驗后撤掉水下平臺進行空間探索實驗， 記錄大鼠60s 內(nèi)穿越原平臺區(qū)域的次數(shù)。

1.6 樣本收集 大鼠麻醉后， 沿中線剪開頭皮，暴露并剪開頭蓋骨，掀開腦膜，將腦剝離，沿大腦矢狀線分別往左右兩邊分開大腦皮層，分離出海馬，收集海馬，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 Western blotting 法檢測BDNF 和TrkB 蛋白及其磷酸化表達水平 精密稱取海馬組織，研磨并用RIPA 裂解液裂解組織，離心取上清液。 考馬斯亮藍法測定蛋白含量。 取樣品加入上樣緩沖液混合，煮沸5min，電泳，轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶封閉1h。 一抗4℃孵育過夜， 上二抗室溫孵育1h，TBST 漂洗15min×3 次。 電致化學(xué)發(fā)光顯色，定影，分析灰度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 21．0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均采用(±s)表示，采用單因素方差分析，組間均值進行t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 水迷宮法觀察茯苓對大鼠學(xué)習(xí)、記憶功能的影響 與模型組相比，假手術(shù)組、茯苓中、高劑量組和戊酸雌二醇組均能明顯減少訓(xùn)練第6 天大鼠第1次經(jīng)過平臺的時間（逃避潛伏期），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 空間探索實驗結(jié)果顯示，與模型組相比，假手術(shù)組、茯苓中、高劑量組和戊酸雌二醇組跨越平臺次數(shù)明顯增加， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 見表1。

2.2 western-blot 技術(shù)檢測各組大鼠海馬組織內(nèi)蛋白水平變化 與假手術(shù)組相比，模型組海馬組織中BDNF 蛋白及TrkB 蛋白的磷酸化表達水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但對TrkB 蛋白總蛋白的表達水平無明顯影響， 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組相比，茯苓中、高劑量組和戊酸雌二醇組均能明顯增加BDNF 蛋白及TrkB 蛋白的磷酸化的表達水平，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但對TrkB 蛋白總蛋白的表達水平無明顯影響，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 見圖1。

表1 各組大鼠水迷宮測試結(jié)果（n=10±s）

與模型組比較：*1P＜0.05

測試指標 逃逸潛伏期（s） 經(jīng)過平臺次數(shù)（次）假手術(shù)組模型組陽性對照組茯苓治療低劑量中劑量高劑量6.12±1.65*1 2.17±0.87 7.24±3.22*1 2.98±1.67 7.11±3.49*1 7.89±3.66*1 11.35±5.87*1 25.36±10.28 13.66±8.94*1 20.53±6.17 14.11±6.52*1 12.68±6.08*1

圖1 6 組大鼠蛋白BDNF、TrkB、pTrkB 表達（n=10±s）

3 討論

茯苓是一種常用中藥， 主要成分為三萜類和多糖類，具有增強免疫功能、利尿、抗炎、保肝、抗衰老等藥理作用[3]。 茯苓改善學(xué)習(xí)記憶方面的研究近些年逐漸增多。 含茯苓的中藥方劑不忘散可以明顯改善絕經(jīng)模型大鼠的認知能力[4]。 茯苓復(fù)合物如遠志茯苓醇提物能改善學(xué)習(xí)記憶障礙模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[5]。 人參-茯苓藥可以多途徑、多通路治療老年性癡呆[6]。 據(jù)中草藥相關(guān)文獻分析：茯苓常用于老年性癡呆及其他原因造成的學(xué)習(xí)記憶能力的提高[2,7]。目前包含茯苓的復(fù)方制劑如安坤顆粒、 坤泰膠囊等中成藥已經(jīng)廣泛用于絕經(jīng)前后諸癥。Morris 水迷宮試驗主要用于評價藥物對空間學(xué)習(xí)記憶能力獲得的影響。 本實驗研究證明： 茯苓能明顯縮短Morris 水迷宮試驗中去卵巢大鼠逃避潛伏期，增加跨越平臺次數(shù)。 因此茯苓對去卵巢大鼠模型的學(xué)習(xí)和記憶能力具有促進作用。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain—derived neurotrophic factor，BDNF）是人體內(nèi)含量最為豐富的神經(jīng)營養(yǎng)因子，主要分布在海馬和大腦皮質(zhì)。 其中與TrkB 受體結(jié)合是BDNF 最主要的信號通路，BDNF 與TrkB 受體結(jié)合后， 通過激活下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在神經(jīng)重塑、 理解和記憶方面扮演重要角色[8]。BDNF 與TrkB 通過參與神經(jīng)細胞的生長發(fā)育及調(diào)節(jié)突觸可塑性等方面， 可調(diào)節(jié)大腦海馬區(qū)的學(xué)習(xí)記憶功能[9]。 本實驗研究證明：模型組海馬組織中BDNF 蛋白及TrkB 蛋白磷酸化的表達水平明顯降低， 而茯苓可以上調(diào)BDNF 蛋白及TrkB蛋白磷酸化的表達水平。

綜上所述，茯苓能夠通過激活BDNF／TrkB 信號通路來促進去卵巢模型鼠學(xué)習(xí)、記憶能力。 茯苓作為一種有效的益智中藥單方制劑，對于AD 患者尤其是絕經(jīng)后婦女記憶障礙的患者， 具有重要的臨床治療意義。