劉伯承，王慧，高帥,2，楊俊，周望平，蔡文杰

（1.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)沙 410131，2.湖南德人牧業(yè)科技有限公司，長(zhǎng)沙 410131）

犢牛腹瀉是奶牛場(chǎng)常見的一種臨床疾病，主要危害1月齡以內(nèi)的犢牛，多表現(xiàn)為爆發(fā)性腹瀉，病程短、死亡率高，往往在一個(gè)時(shí)期內(nèi)發(fā)病率可達(dá)80%，給養(yǎng)牛業(yè)帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。引起犢牛腹瀉的主要病原體有細(xì)菌、病毒和隱孢子蟲，細(xì)菌性的有大腸桿菌、沙門氏菌、魏氏梭菌，病毒性的有牛病毒性腹瀉病毒、牛冠狀病毒、牛輪狀病毒，其中由致病性大腸桿菌引起犢牛腹瀉的占90%[2]，隱孢子蟲是牛場(chǎng)環(huán)境中的常見寄生蟲，可單獨(dú)或與其他病原混合感染[3]。另外，一些非感染性因素如環(huán)境變化、氣候變化、飼養(yǎng)管理等也是引起犢牛腹瀉的重要原因。由于犢牛腹瀉病因復(fù)雜，給防控該病造成了很大的困難。2019年10月，湖南常德市某牛場(chǎng)26頭犢牛發(fā)生腹瀉，為了確診發(fā)病原因，無菌采集病死牛的腸內(nèi)容物、腸組織、糞樣送實(shí)驗(yàn)室，采用RT-PCR技術(shù)，對(duì)牛病毒性腹瀉病毒、牛輪狀病毒、牛冠狀病毒、隱孢子蟲、大腸桿菌毒力基因及黏附素進(jìn)行了核酸檢測(cè)，并采用紙片法（K-B）進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，為臨床治療提供參考。

1 臨床癥狀

該場(chǎng)共有460頭荷斯坦牛，88頭哺乳犢牛，腹瀉26頭，死亡22頭，發(fā)病年齡在15～40日齡間，病程在10日內(nèi)。1～3日，病牛出現(xiàn)輕度腹瀉，排白色黏稠糞便，少數(shù)出現(xiàn)高溫（40～41℃），輕度厭食；3～4日，腹瀉加重糞便呈蛋花水樣（圖1），體溫正常；5日后出現(xiàn)低溫（35～37℃），脫水，昏厥，精神狀態(tài)極差；7日左右治療無效死亡。

2 病理變化

解剖發(fā)現(xiàn)心臟有白色炎癥，肺部呈黃色，易碎，有黃色黏稠液體。脾臟、肝臟無明顯病變，胃內(nèi)有未消化奶塊與草料，小腸有水腫和出血（圖2）。

3 樣品采集

無菌采集4頭病死牛的腸內(nèi)容物、腸組織、糞樣，編號(hào)45號(hào)、57號(hào)、33號(hào)、59號(hào)，放入冷藏箱，送華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

圖1 糞便

圖2 小腸

4 試驗(yàn)方法

4.1 牛病毒性腹瀉病毒核酸檢測(cè)

利用病毒RNA提取試劑盒從血清中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以其為模板用牛病毒性腹瀉病毒鑒定性引物通過PCR檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒，PCR產(chǎn)物的預(yù)期大小為201bp。

4.2 牛輪狀病毒核酸檢測(cè)

利用病毒RNA提取試劑盒從糞便中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以其為模板用輪狀病毒鑒定性引物通過PCR檢測(cè)牛輪狀病毒，PCR產(chǎn)物的預(yù)期大小為294bp。

4.3 牛冠狀病毒核酸檢測(cè)

利用病毒RNA提取試劑盒從糞便中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以其為模板用冠狀病毒鑒定性引物通過PCR檢測(cè)牛冠狀病毒，PCR產(chǎn)物的預(yù)期大小為488bp。

4.4 隱孢子蟲核酸檢測(cè)

利用糞便DNA提取試劑盒從糞便中提取DNA，然后用隱孢子蟲鑒定性引物通過巢式PCR檢測(cè)隱孢子蟲核酸，PCR產(chǎn)物的預(yù)期大小為830bp。

4.5 大腸桿菌毒力基因檢測(cè)

對(duì)采集的樣品進(jìn)行鑒別培養(yǎng)、鑒定大腸桿菌，核酸檢測(cè)大腸桿菌毒力基因Stx1、Stx2、eae、astA、sta、stb、lt 及大腸桿菌黏附素K88、K99基因。

4.6 藥敏試驗(yàn)

用藥敏紙片擴(kuò)散法（K-B）對(duì)分離鑒定的astA毒力基因大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，參考臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。

5 結(jié)果

利用RT-PCR檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒核酸、牛輪狀病毒核酸、牛冠狀病毒核酸，均未檢測(cè)到核酸陽性樣本（圖3～5）；利用巢式PCR檢測(cè)隱孢子蟲核酸，檢出1個(gè)陽性樣本，陽性率為25%（圖6）；核酸檢測(cè)大腸桿菌毒力基因，在57-2小腸、45-2腸組織、45-3腸組織3個(gè)樣品中分別檢測(cè)出astA毒力基因，未檢測(cè)出其他黏附素及毒力基因；3個(gè)樣品分離出的大腸桿菌對(duì)紅霉素、慶大霉素等10種常用抗生素全部嚴(yán)重耐藥，耐藥率達(dá)100%（表1）。

圖3 牛病毒性腹瀉病毒核酸檢測(cè)結(jié)果

圖4 牛輪狀病毒核酸檢測(cè)結(jié)果

圖5 牛冠狀病毒核酸檢測(cè)結(jié)果

圖6 隱孢子蟲核酸檢測(cè)結(jié)果

表1 astA毒力基因大腸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

6 討論與分析

6.1 菌毒力基因檢測(cè)分析

隨著養(yǎng)牛業(yè)規(guī)?；瘮U(kuò)大和集約化生產(chǎn)程度的提高，犢牛腹瀉在養(yǎng)牛場(chǎng)中發(fā)病率和死亡也呈上升趨勢(shì)[4]，致病性大腸桿菌是引起犢牛腹瀉的主要病原體，其致病性并不完全與血清型有關(guān)，而主要是取決于其所產(chǎn)生的特定的毒力因子，如菌毛、鐵攝取系統(tǒng)、外膜蛋白以及毒素等[5]，因此，毒力基因的檢測(cè)已成為確定致病性大腸桿菌的常用方法[6]。從實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果可以看出，該牛場(chǎng)犢牛腹瀉發(fā)病主要由腸聚集性大腸桿菌（EAEC）和牛隱孢子蟲混合感染導(dǎo)致。astA基因是編碼腸聚集性耐熱毒素，與大腸埃希菌sta腸毒素基因有類似的性質(zhì)[7]。張金寶等人的研究發(fā)現(xiàn)，致腹瀉大腸桿菌攜帶的毒力基因較多，經(jīng)常以兩種或兩種以上的毒力基因同時(shí)出現(xiàn)[8～10]，本次致犢牛腹瀉大腸桿菌樣品中僅檢出astA一種毒力基因，結(jié)果與前人研究差異較大。目前牛源致腹瀉大腸桿菌中astA毒力基因的相關(guān)研究較少，從發(fā)病日程、臨床解剖、死亡率（85%）和astA檢出率（75%）來看，本次致犢牛腹瀉大腸桿菌致病力較強(qiáng)，astA毒力基因介導(dǎo)的致病機(jī)理值得進(jìn)一步研究。

6.2 耐藥性分析

由于抗生素藥物使用量的不斷加大和耐藥基因的擴(kuò)散和傳播，大腸桿菌的耐藥性正變得日益嚴(yán)重[11]，多重性耐藥和耐藥率也不斷增高。本藥敏試驗(yàn)表明，3個(gè)樣品astA毒力基因大腸桿菌對(duì)受試的10種腸桿菌抗生素全部耐藥，敏感率為0，耐藥率為100%，與元振杰[12]等人對(duì)致腹瀉大腸桿菌耐藥性研究結(jié)果相差較大，該研究對(duì)氨芐西林、復(fù)方新諾明、慶大霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星敏感性分別為22.5%、30.4%、40.2%、41.2%、46.1%，這可能與本研究中的牛場(chǎng)長(zhǎng)期使用抗生素有關(guān)，但本次藥敏試驗(yàn)受試樣品數(shù)量過少，不能完全說明問題。目前，耐藥性已經(jīng)成為養(yǎng)殖生產(chǎn)中的突出問題，因此，養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)降低和規(guī)范使用抗生素，在防治過程中盡量用中草藥制劑及抗生素替代品。

6.3 隱孢子蟲

隱孢子蟲是引起犢牛腹瀉的重要寄生蟲，通過受污染的水源和食物等途徑傳播。劉毅[13]對(duì)湖南省8個(gè)縣隱孢子蟲感染牛進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3、4月齡犢牛的感染率分別為100%、60%；Muhid等[14]對(duì)馬來西亞16個(gè)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)的隱孢子蟲感染率研究顯示，隱孢子蟲對(duì)斷奶前和斷奶后犢牛的感染率分別為30.8%和23.3%，牛隱孢子蟲、瑞氏隱孢子蟲和安氏隱孢子蟲對(duì)斷奶后犢牛的感染率分別為35%、30%和30%，說明幼齡牛比其他年齡階段牛感染率更高。黃柳梅[15]研究表明，我國(guó)部分省份的隱孢子蟲病的感染率在4.49%、24%、19.71%、19.09%、13.65%、21.5%。本次檢測(cè)隱孢子蟲陽性率為25%（1/4），大部分調(diào)查研究認(rèn)為，牛場(chǎng)隱孢子蟲的感染率高低與環(huán)境衛(wèi)生有著重要的關(guān)系，因此，加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生管理，做好殺蟲、消毒滅源等工作，對(duì)預(yù)防犢牛腹瀉至關(guān)重要。

綜上所述，預(yù)防犢牛腹瀉建議從以下幾個(gè)方面進(jìn)行：①防止病畜糞便污染食物和飲水，控制傳染源并注意環(huán)境衛(wèi)生，做好新生犢牛隔離飼養(yǎng)，防止相鄰犢牛糞便接觸；根據(jù)牛隱孢子蟲卵囊的排出規(guī)律，對(duì)帶蟲牛舍的消毒及清掃應(yīng)選擇在早晨，用10%福爾馬林、5%氨水或65℃以上30min均可殺死卵囊；病畜應(yīng)隔離飼養(yǎng)，根據(jù)病情及時(shí)補(bǔ)液（氯化鈉、碳酸氫鈉、VC），防止脫水與酸中毒，采用抗菌消炎類中藥灌服，用磺胺類藥物驅(qū)蟲，防止隱孢子蟲繼發(fā)感染。②給母畜和新生幼畜提供良好的營(yíng)養(yǎng)，保證幼畜出生2h內(nèi)，最遲不超過6h，吃到自身體重5%的高質(zhì)量初乳，建立最佳的非特異性免疫。③在分娩前6周或2周給妊娠母牛接種大腸桿菌疫苗。④做好牛場(chǎng)內(nèi)帶牛消毒，每天更換一次墊料。⑤適當(dāng)通風(fēng)，保持舍內(nèi)溫度，給犢牛喝燒開過的溫水。