張 濤， 郭一民， 李卓揚， 席果果， 左 磊， 曹永平， 王雅泓

(1.鄭州大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.北京航空航天大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，北京 100191；3.北京大學(xué)第一醫(yī)院 骨科，北京 100034；4.哈爾濱成程生命與物質(zhì)研究所，黑龍江 哈爾濱 150500)

0 引言

納米材料在癌癥治療中越來越受到重視，但在提高治療效果和減少副作用方面仍面臨巨大挑戰(zhàn)[1-11]。其中，碳納米材料因其獨特的物理化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)引起了人們極大的興趣[3-6]。碳量子點(CQDs)是繼富勒烯、碳納米管和石墨烯之后的新型碳納米材料。碳量子點具有強熒光、寬波長連續(xù)激發(fā)光、發(fā)射光可調(diào)的優(yōu)良電子受體和給體、良好的水溶性、低生物毒性等特點[12-17]，因此，碳量子點被認為是一種理想的生物醫(yī)學(xué)材料，在生物醫(yī)學(xué)和細胞成像領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[12]。除了進一步推進碳量子點的現(xiàn)有應(yīng)用外，探索其新的應(yīng)用領(lǐng)域同樣具有重要意義。

由于碳量子點具有很強的熒光特性，在腫瘤研究領(lǐng)域，它主要被應(yīng)用于生物標記、細胞成像等方面。例如，人類乳腺癌細胞可以用碳量子點標記。不同粒徑的碳量子點可以到達細胞內(nèi)不同的位置，因此不同粒徑的碳量子點可以標記細胞的不同部位。近年來，碳量子點已被用作腫瘤治療的藥物載體[18]，然而關(guān)于碳量子點如何直接影響腫瘤細胞的報道卻很少。富勒烯衍生物的抗腫瘤特性已被報道，盡管它們對正常人體細胞仍具有一定的細胞毒性[19-20]，但據(jù)此也可以期望碳量子點可能會對腫瘤細胞產(chǎn)生一些影響。本研究的目的是制備一種穩(wěn)定的碳量子點溶膠，該溶膠能誘導(dǎo)癌細胞凋亡，但對正常的人體細胞幾乎無損傷。本文研究認為碳量子點的尺寸和表面特性在抗腫瘤中起著重要的作用。據(jù)報道，合成具有不同粒徑、性質(zhì)的穩(wěn)定碳量子點溶膠有多種方法[21-25]，在這些方法中，石墨脈沖電解法是一種有效的方法。

肝癌位居全球常見癌癥第6位，55%患者是中國人，但肝癌藥物治療的臨床療效還不盡人意，尋找能有效誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的藥物迫在眉睫[26-28]。正因此，本文首先考慮以人體肝癌細胞作為對象驗證碳量子點溶膠的抗腫瘤效果。采用脈沖電解法成功制備了穩(wěn)定的碳量子點溶膠，并首次報道了其對人體肝癌細胞(HepG2細胞)的生物毒性。利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)和流式細胞儀，通過體外細胞實驗對腫瘤細胞的凋亡進行檢測以確定其抗腫瘤效果。用透射電子顯微鏡觀察了HepG2細胞對碳量子點的內(nèi)吞作用。同時，通過體外實驗檢測碳量子點對人體淋巴細胞的影響以研究其免疫毒性。除了體外試驗外，活體動物實驗也證實了碳量子點的抗腫瘤作用，這部分結(jié)果將在其他地方討論。簡言之，本文所描述的實驗結(jié)果為碳量子點的進一步生物應(yīng)用提供了重要的參考信息。

1 試驗方案

1.1 試驗材料

胎牛血清、Dulbecco改良eagle培養(yǎng)基(DMEM，high glucose containing sugar L-glutamine)、胰蛋白酶-EDTA消化液(trypsin-EDTA digestion，0.25%)、青霉素-鏈霉素溶液(penicillin-streptomycin solution，100×)和磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)購自美國的Sigma-Aldrich公司。CCK-8和Annexin V-FITC/DAPI雙染色細胞凋亡檢測試劑盒從中國凱基生物有限公司購買。Triton X-100和人體外周血液淋巴細胞分離培養(yǎng)基購自美國的Invitrogen公司。其他化學(xué)試劑為分析純。石墨板(100 mm×30 mm×5 mm，純度(質(zhì)量分數(shù))為99.9%)購自北京吉星盛安有限公司(中國)。新鮮人體外周血淋巴細胞采集于某醫(yī)院門診患者。

1.2 碳量子點溶膠的制備與表征

石墨板(100 mm×30 mm×5 mm，純度(質(zhì)量分數(shù))99.9%)作為制備該溶膠的碳源。采用脈沖電解法制備碳量子點溶膠。具體電解方法為：將2塊石墨板平行放置于水槽(150 mm×80 mm×60 mm)中，板間距為10 mm，然后注入500 mL去離子水，接著將2塊石墨板分別連接單極脈沖電源(京新電源設(shè)備有限公司，中國)的正、負極，通電電解(電壓為5 V，頻率為20 kHz)一定時間后即可制備出該碳量子點溶膠。為了獲得更細的顆粒，在150 MPa壓力下對該原始膠體進行均化處理，每個樣品處理15次。

將溶膠滴到硅片上，在空氣中干燥，制備出用于X射線衍射儀(XRD，D/max 2500)檢測的樣品。將碳量子點溶膠滴到孔徑48 μm的銅微柵上(Ted Pella)，待其在空氣中干燥后，在200 kV下使用透射電子顯微鏡(TEM，JEM-2100F)觀察樣品。利用Image J軟件對TEM圖像進行分析，從而確定其尺寸。

1.3 細胞培養(yǎng)

人體肝癌細胞(HepG2細胞)購自American Type Culture Collection公司。HepG2細胞于DMEM培養(yǎng)基(混入體積分數(shù)為10%的熱滅活胎牛血清和100 μg/mL的青霉素-鏈霉素溶液)中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時溫度為37 ℃，CO2體積分數(shù)為5%。選擇對數(shù)生長期細胞(logarithmic growth phase cells)制備成細胞懸液，然后將懸液隨機分為4組，接種于96孔培養(yǎng)板(culture plate)中直至貼壁，培養(yǎng)板每孔體積為100 μL(1×105個細胞/孔)。從外周血液中分離出淋巴細胞，并用上述方法進行培養(yǎng)。

1.4 碳量子點溶膠對HepG2細胞毒性的體外研究

用CCK-8檢測碳量子點溶膠對HepG2細胞的毒性。簡單地說，HepG2細胞(1×105個細胞/孔)在96孔培養(yǎng)板中，于37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2環(huán)境下用100 μL的新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，用不同質(zhì)量濃度的碳量子點溶膠(C1=69 μg/mL，C2=138 μg/mL，C3=276 μg/mL)處理HepG2細胞24、48、72 h，然后加入10 μL的CCK-8溶液(2 mg/mL)。孵化2 h后，用微型讀板器(Bio-Rad，CA，美國)在450 nm的測試波長和630 nm的參考波長下測量吸光度(OD值)。試驗重復(fù)進行3次。用光學(xué)顯微鏡進一步觀察經(jīng)濃度分別為C2和C3的碳量子點溶膠處理72 h后的細胞形態(tài)學(xué)變化。取未經(jīng)碳量子點溶膠處理的樣品作為對照組。

1.5 HepG2細胞凋亡檢測

選用Annexin V-FITC/DAPI雙染法檢測HepG2細胞的凋亡情況。Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(apoptosis detection kit)是通過檢測細胞表面磷脂酰絲氨酸來檢測早期細胞凋亡的敏感指標之一。DAPI作為一種核酸染料，只能染紅中晚期的凋亡細胞和死亡細胞。在96孔板上培養(yǎng)細胞，然后用不同質(zhì)量濃度(C1=69 μg/mL，C2=138 μg/mL，C3=276 μg/mL)的碳量子點溶膠對細胞進行處理。孵化48 h和72 h后，除去胰酶消化液的EDTA，收集細胞。隨后，離心棄上清，用PBS漂洗2遍，收集到流式管(flow tube)中。然后，加入500 μL的緩沖液(binding buffer)使細胞懸浮。加入50 μL Annexin V-FITC/DAPI染料，室溫避光孵育15 min。最后，立即使用流式細胞儀(flow cytometry，BD FACSCantoTMII，San Jose，CA)分析。

1.6 細胞形態(tài)學(xué)觀察

將HepG2細胞以1×105個細胞/孔的密度在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜，然后用C3質(zhì)量濃度的碳量子點溶膠處理72 h，最后用透射電子顯微鏡觀察處理組和對照組的HepG2細胞形態(tài)及碳量子點在HepG2細胞內(nèi)的分布。

1.7 碳量子點溶膠對淋巴細胞毒性的體外研究

簡言之，淋巴細胞(1×105個細胞/孔)在96孔板中，用100 μL新鮮培養(yǎng)液在37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2環(huán)境下進行培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，用不同質(zhì)量濃度(C1、C2、C3)的碳量子點溶膠處理淋巴細胞24、48和72 h，然后加入10 μL的CCK-8溶液(2 mg/mL)。孵化2 h后，用微型讀板器(Bio-Rad，CA，美國)在450 nm的測試波長和630 nm的參考波長條件下測量吸光度。試驗重復(fù)進行3次。取未經(jīng)碳量子點溶膠處理的樣品作為對照組。

1.8 統(tǒng)計分析方法

用IBM SPSS Statistics 20進行統(tǒng)計分析。采用Wilcoxon檢測法研究處理組和對照組在細胞存活率上的差異。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差(SD)表示。當(dāng)P< 0.05時，認為具有統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著差異。

2 分析與討論

采用CCK-8評價碳量子點對HepG2細胞的毒性(圖2)。數(shù)據(jù)表明，細胞活性受到了抑制，并且溶膠濃度和時間會對這種抑制效果產(chǎn)生影響。在處理72 h后，C2組和C3組展現(xiàn)出高于其他組的細胞毒性，而低濃度組(C1組)在測試期內(nèi)展現(xiàn)的毒性不顯著。結(jié)果表明，C2和C3處理72 h條件下碳量子點溶膠對腫瘤細胞具有顯著的毒性。光學(xué)顯微鏡觀測結(jié)果進一步驗證了溶膠濃度對細胞毒性的影響(圖3)。

圖1 碳量子點溶膠的材料學(xué)表征Figure 1 The material characterization of the as-prepared CQDs

圖2 碳量子點溶膠的質(zhì)量濃度對HepG2細胞的體外細胞毒性的影響(誤差棒指標準偏差(n=3))Figure 2 In vitro cytotoxicity of CQDs on HepG2 cells(Error bars indicate SD (n=3))

采用Annexin V-FITC/DAPI雙染法研究碳量子點溶膠的細胞凋亡誘導(dǎo)能力。基于聯(lián)合染色法，利用流式細胞儀可區(qū)分早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞。流式細胞分析結(jié)果(圖4)顯示，經(jīng)碳量子點溶膠處理72 h后的HepG2細胞，C1、C2和C3對應(yīng)的總凋亡率分別為19.38%、22.86%和28.73%。C2、C3組細胞凋亡率明顯高于對照組(16.68%，P<0.05)，與細胞毒性試驗結(jié)果一致(圖2)。該部分結(jié)果表明，碳量子點溶膠是一種有效的抗腫瘤藥物，可誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡。

通過TEM觀察碳量子點與在C3質(zhì)量濃度下孵化72 h后的HepG2細胞之間的相互作用，以檢測它們可能的內(nèi)吞現(xiàn)象(圖5)。未經(jīng)碳量子點溶膠處理的細胞未見異常。但是對于處理后的細胞，可以看到，碳量子點被HepG2細胞攝取并積累在細胞質(zhì)內(nèi)，說明細胞成功攝取了碳量子點。碳量子點的目標似乎是細胞的線粒體。從圖5中可以看出，HepG2細胞的線粒體有明顯腫脹，冠(crests)消失。這些結(jié)果表明，碳量子點可能對線粒體有害，從而誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡。碳量子點在HepG2細胞線粒體中積累的趨勢被認為與活性氧的產(chǎn)生有關(guān)，活性氧可導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)，具體相關(guān)機理可參考Ag-NPs的有關(guān)報道[29]。然而，碳量子點在線粒體中的沉積機制尚不清楚。因此，需要進一步研究碳量子點溶膠對線粒體的影響，以及碳量子點的內(nèi)吞途徑。

圖3 在不同濃度碳量子點溶膠中培養(yǎng)72 h后HepG2細胞的代表性光學(xué)顯微照片F(xiàn)igure 3 Representative optical microscopy images of HepG2 cells incubated with CQDs of different concentrations for 72 h

圖4 經(jīng)過不同濃度的碳量子點溶膠處理72 h后HepG2細胞凋亡的流式細胞儀分析結(jié)果Figure 4 Flow cytometry analysis of HepG2 cells’ apoptosis after treatment with CQDs of different concentrations for 72 h

圖5 經(jīng)碳量子點溶膠處理72 h后的HepG2細胞的TEM照片(黑色箭頭表示細胞內(nèi)部的碳量子點，白色箭頭表示線粒體)Figure 5 TEM images of HepG2 cells after incubation with CQDs for 72 h(The black arrow denotes the CQDs inside cells, and the white arrow shows the mitochondrion of HepG2 cells)

以上結(jié)果一致表明碳量子點溶膠對HepG2細胞具有較強的細胞毒性。顯然，應(yīng)當(dāng)考慮碳量子點溶膠對正常人體細胞可能產(chǎn)生的毒性，因此本文采用CCK-8來研究碳量子點溶膠對人體淋巴細胞的毒性。如圖6所示，與HepG2細胞相比，在不同的質(zhì)量濃度和時間條件下經(jīng)碳量子點溶膠處理后，淋巴細胞的活性均無明顯變化。綜合以上結(jié)果，可發(fā)現(xiàn)本文制備的碳量子點溶膠對HepG2細胞具有顯著的靶向攻擊能力，對淋巴細胞并沒有顯示出明顯的毒性。

3 結(jié)論

采用石墨脈沖電解法制備了穩(wěn)定的碳量子點溶膠。對碳量子點溶膠的基本性質(zhì)進行了系統(tǒng)研究。碳量子點呈近似球形，粒徑范圍及平均粒徑分別為3.73～10.19 nm和6.93 nm。紅外光譜分析及光致發(fā)光光譜表明碳量子點表面含有多種含氧官能并具有熒光特性。碳量子點溶膠可誘導(dǎo)肝癌細胞的凋亡，但對人體淋巴細胞無明顯影響。透射電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示碳量子點通過對線粒體產(chǎn)生損傷從而誘導(dǎo)人體肝癌細胞凋亡。雖然誘導(dǎo)凋亡的機制是由基因表達引起的還是代謝活動的結(jié)果還不能確定并有待于進一步研究，但是具有選擇性誘導(dǎo)癌細胞凋亡作用的碳量子點溶膠有望成為新型無毒副作用的抗癌藥物。

圖6 碳量子點溶膠的濃度(C1、C2、C3)和處理時間(24、48、72 h)對人體淋巴細胞的體外細胞毒性的影響(誤差線表示標準偏差(n=3))Figure 6 In vitro cytotoxicity of CQDs on human lymphocytes at C1, C2, C3 for 24, 48 and 72 h (Error bars indicate SD (n=3))