黃天卓，丁薇娜，張琳杰，鄭浩然，何鑫磊

(美倫醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，天津 300403)

腎茶(Clerodendranthus spicatus (Thunb.) C. Y. Wu)又稱貓須草、貓須公、腎草，是唇形科，腎茶屬多年生草本植物。腎茶具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌、抗氧化、利尿的作用，其還對(duì)肝臟腎臟有一定的保護(hù)作用[1]。臨床上腎茶常在國(guó)內(nèi)被用來(lái)治療慢性腎炎、膀胱炎、尿路結(jié)石等，在國(guó)外也被用來(lái)治療糖尿病、高血壓，其含有黃酮類、酚酸類、木脂素類、二萜類、三萜類、色原烯類、甾體類、糖苷類和香豆素類等，其中熊果酸具有良好的抗炎作用[2]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)熊果酸還具有抗癌的效果，因此其商業(yè)價(jià)值非常高[3]。腎茶提取物中化學(xué)成分復(fù)雜，目前很多熊果酸的HPLC檢測(cè)方法測(cè)得的腎茶醇提液中熊果酸的峰形并不符合《中國(guó)藥典》的要求，為了進(jìn)一步利用腎茶提取物開(kāi)發(fā)藥物制劑及建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，美倫醫(yī)藥集團(tuán)有限公司研發(fā)部利用HPLC法建立了能較好分離腎茶提取物中熊果酸的分析方法并對(duì)其進(jìn)行了方法學(xué)考察研究。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1.1 儀器

1.2 試劑

乙腈186340(ThermoFisher Scientific)、娃哈哈礦泉水20181003(沈陽(yáng)娃哈哈飲料有限公司)、磷酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)、四氫呋喃20181201(天津市大茂化學(xué)試劑廠)、熊果酸對(duì)照品110742-201915(中國(guó)藥品檢定研究院)、腎茶醇提液(美倫醫(yī)藥研發(fā)部提供)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品的制備

由美倫醫(yī)藥集團(tuán)有限公司藥品研究院提供。

2.1.2 對(duì)照品的制備

精密稱量熊果酸對(duì)照品2.90 mg(94.7%)，用10 mL甲醇溶解，定容到10 mL容量瓶中即得274.63 μg/mL熊果酸對(duì)照溶液。

2.1.3 流動(dòng)相的制備

乙腈∶0.45 μm過(guò)濾后超聲30 min、0.1%磷酸：取1 mL磷酸加入到1 L水中混勻，0.45 μm過(guò)濾后超聲30 min、5%四氫呋喃∶取50 mL四氫呋喃加入到1 L水中，0.45 μm過(guò)濾后超聲30 min、5%四氫呋喃(0.1%磷酸)∶取50 mL四氫呋喃加入到1 L 0.1%磷酸水中，0.45 μm過(guò)濾后超聲30 min。

2.2 色譜條件

2.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)考察

寬甸縣年最高氣溫整體呈周期性變化如圖2所示。1989—1997年為一個(gè)變化周期，2000年最高氣溫為36.5℃，為歷史最高；2006年最高氣溫為30.7℃，為歷史最低；兩者相差5.8℃。2009—2013年最高氣溫逐年降低，2015年最低氣溫為一個(gè)極低值，2016年最高氣溫開(kāi)始回升。

液相設(shè)置波長(zhǎng)范圍為190～400 nm，對(duì)熊果酸全波長(zhǎng)吸收檢測(cè)，記錄圖譜。從圖1可以看出熊果酸最大吸收波長(zhǎng)在200 nm左右，固設(shè)置190、203、210 nm波長(zhǎng)進(jìn)行試驗(yàn)，圖2、圖3、圖4顯示203 nm波長(zhǎng)下的熊果酸色譜峰符合要求并且吸收值最大。

圖1 腎茶供試品3D吸收?qǐng)D

圖2 波長(zhǎng)190 nm下熊果酸對(duì)照色譜峰

圖3 波長(zhǎng)203 nm下熊果酸對(duì)照色譜峰

圖4 波長(zhǎng)210 nm下熊果酸對(duì)照色譜峰

2.2.2 流動(dòng)相系統(tǒng)考察

分別使用五種不同配比流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)：①乙腈∶水=68∶32、②乙腈∶0.1%磷酸=68:32、③乙腈∶1%四氫呋喃(0.1%磷酸)=68∶32、③乙腈∶3%四氫呋喃(0.1%磷酸)=68∶32、③乙腈∶5%四氫呋喃(0.1%磷酸)=68∶32，結(jié)果見(jiàn)表1、圖5。從結(jié)果看出分離度和拖尾因子均符合要求的只有③和⑤，為了增大以后檢測(cè)的容錯(cuò)率，故選用⑤乙腈∶5%四氫呋喃(0.1%磷酸)=68∶32為熊果酸檢測(cè)流動(dòng)相。

表1 流動(dòng)相系統(tǒng)考察

①乙腈∶水=68∶32、②乙腈∶0.1%磷酸=68∶32、③乙腈∶1%四氫呋喃(0.1%磷酸)=68∶32、③乙腈∶3%四氫呋喃(0.1%磷酸)=68∶32、③乙腈∶5%四氫呋喃(0.1%磷酸)=68∶32。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 色譜條件

色譜柱：GL Science C18(4.6×250 mm，5 μm)、流動(dòng)相為乙腈-5%四氫呋喃(0.1%磷酸)=68∶32，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm；柱溫：33℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

2.3.2 專屬性

取腎茶醇提液、熊果酸對(duì)照品溶液、空白溶劑按2.3.1的條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖6。結(jié)果顯示空白溶劑不干擾檢測(cè)，熊果酸能與臨近峰分離度>1.5，拖尾因子在0.95～1.05。

圖6 腎茶提取物專屬性考察色譜圖

2.3.3 線性

液相程序調(diào)整2.1.2中熊果酸對(duì)照品溶液進(jìn)樣量分別為2、4、6、8、10、12 μL，記錄色譜圖。根據(jù)表1分析得出回歸方程為y=4401.2196x-14708.6，R=1.0000，表明該方法測(cè)得的熊果酸含量在54.926 ～329.556 μg是準(zhǔn)確的。

表 2 腎茶供試品中熊果酸檢測(cè)方法學(xué)考察-線性

2.3.4 耐用性

表3 耐用性(溫度、流速、流動(dòng)相組成)峰面積RSD%

圖7 腎茶供試品中熊果酸檢測(cè)方法學(xué) 考察色譜圖-耐用性(溫度)

圖8 腎茶供試品中熊果酸檢測(cè)方法學(xué) 考察色譜圖-耐用性(流速)

除各考察項(xiàng)變動(dòng)外，其余項(xiàng)均同2.3.1中色譜條件。①柱溫：32、33、34℃；②流速：0.95、1.0、1.05 mL/min；③色譜柱型號(hào)：7F3719-07 wondaSil c18、6k3708-01 wondaSil c18、4DG71569 wondaCract OD；④流動(dòng)相組成：乙腈-5%四氫呋喃(0.1%磷酸)=67∶33、68∶32、69∶31，結(jié)果見(jiàn)表3和圖7～9。結(jié)果表明在柱溫、流速、色譜柱或流動(dòng)相組成發(fā)生微小變化時(shí)，熊果酸的峰面積基本保持一致，滿足系統(tǒng)適用性要求。

圖9 腎茶供試品中熊果酸檢測(cè)方法學(xué) 考察色譜圖-耐用性(流動(dòng)相比例)

2.3.5 重復(fù)性

平行制備6份腎茶醇提液作為供試品，按2.3.1的條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖10，并計(jì)算熊果酸含量和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差RSD。重復(fù)性試驗(yàn)峰面積的RSD=0.980%<3%，符合要求，重復(fù)性良好。

圖10 腎茶供試品中熊果酸檢測(cè)方法學(xué)考察色譜圖-重復(fù)性

2.3.6 準(zhǔn)確度

取腎茶醇提液9份，每份2 mL，這9份供試液再分為三組，按其中熊果酸含量的0.5倍、1倍、1.5倍添加熊果酸對(duì)照品，混勻后過(guò)0.45 μm濾膜，按2.3.1中條件進(jìn)樣，記錄譜圖，根據(jù)重復(fù)性試驗(yàn)的結(jié)果計(jì)算各供試溶液中熊果酸含量，并計(jì)算回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。準(zhǔn)確度的試驗(yàn)結(jié)果在92%～105%范圍內(nèi)，回收率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=2.04%，表明該法測(cè)熊果酸含量的結(jié)果與實(shí)際值較為接近，準(zhǔn)確度較好。

表4 腎茶供試品中熊果酸檢測(cè)方法學(xué)考察-準(zhǔn)確度(加標(biāo)回收率)

3 討論

熊果酸是腎茶中起主要藥理作用的化學(xué)物質(zhì)之一，目前已有的制劑將其定為質(zhì)量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，但該制劑上市時(shí)間早，檢測(cè)方法薄層層析不夠準(zhǔn)確。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用目前已發(fā)表的文獻(xiàn)中對(duì)熊果酸檢測(cè)的方法進(jìn)行試驗(yàn)[4-6]，均難以達(dá)到《中國(guó)藥典2020》[7]中規(guī)定的分離度大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05之間，因此建立腎茶中熊果酸的HPLC檢測(cè)方法對(duì)腎茶新制劑的開(kāi)發(fā)具有重要的研究指導(dǎo)意義。

本研究主要通過(guò)HPLC法建立腎茶中熊果酸的檢測(cè)方法并進(jìn)行方法學(xué)考察，為其鑒定和質(zhì)量控制提供標(biāo)準(zhǔn)，該法檢測(cè)到的熊果酸不僅能有較好的分離度，而且檢驗(yàn)時(shí)間短，大大縮短了藥品研發(fā)所需要的時(shí)間。參照《中國(guó)藥典2020》，本研究分別對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)、專屬性、耐用性、重復(fù)性和準(zhǔn)確度進(jìn)行考察，其結(jié)果均符合《中國(guó)藥典2020》要求。

在多次研究探索過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)添加四氫呋喃可以調(diào)整峰形，但其也有減少出峰時(shí)間的作用，因此不宜添加過(guò)多，以免造成分離度不夠；四氫呋喃還可能腐蝕柱子或者液相里的某些零件，使用時(shí)應(yīng)當(dāng)注意器材是否會(huì)被四氫呋喃腐蝕；四氫呋喃容易被氧化，因此用之前需要檢查試劑瓶中液體是否有分層現(xiàn)象。