孫亞敏，欒會妮，徐勤娟，李錫勇

(威海海洋職業(yè)學院，山東 威海 264300；)

枸櫞酸莫沙必利(Mosapride Citrate)為大日本制藥株式會社開發(fā)的胃動力藥，是一強效選擇性5-羥色胺(5-HT4)受體激動劑，通過興奮肌間神經(jīng)叢的5-HT4受體，刺激乙酰膽堿釋放，從而增強胃腸運動，但不影響胃酸分泌，是一安全有效的胃動力藥[1-2]。臨床用于慢性胃炎、功能性消化不良、反流性食管炎及手術(shù)伴隨的一系列胃腸道癥狀的緩解[3]。本實驗參照相關(guān)文獻[4-5]和JP16版Mosapride Citrate Powder質(zhì)量標準，進一步優(yōu)化色譜條件，采用梯度洗脫，建立了檢測枸櫞酸莫沙必利分散片有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜法，為枸櫞酸莫沙必利分散片的質(zhì)量研究提供了有效的分析手段。

1 實驗部分

儀器與試劑

Waters e2695高效液相色譜儀(配有四元泵、在線脫氣機、自動進樣器、2998 PDA檢測器、2489UV檢測器、Empower工作站)；Mettler Toledo XS205電子天平；Mettler Toledo SevenEasy pH計；SK8200LH數(shù)控超聲波清洗儀(上?？茖С晝x器有限公司)。

枸櫞酸莫沙必利對照品(批號：100656-200501，中國藥品生物制品檢定所)，雜質(zhì)A(批號：7-DPM-9-2，TRC)，雜質(zhì)B(批號：13-SWZ-97-2，TRC)，雜質(zhì)C(批號：4-DPM-73-4，TRC)，枸櫞酸莫沙必利原料(批號：130301，國內(nèi)某公司自制)，枸櫞酸莫沙必利分散片(批號：130801、130802、130803，自制)。所用試劑除乙腈為色譜純之外，其它均為分析純。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件

色譜柱為Welch SX-C18(4.6×150mm，5μm)；以0.05mol/L的枸櫞酸溶液(用2mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至4.0)為流動相A，以乙腈為流動相B，按下表梯度程序進行洗脫；檢測波長為274nm；柱溫為40℃；進樣體積為10μl；稀釋液為乙腈-水(40∶60)。

表1 色譜條件

2.2 溶液的配制

取枸櫞酸莫沙必利分散片細粉適量(約相當于枸櫞酸莫沙必利25mg)，置25mL量瓶中，加稀釋液超聲使枸櫞酸莫沙必利溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；精密量取供試品溶液適量，用稀釋液定量稀釋200倍，搖勻，作為對照溶液(0.5%)。

2.3 空白輔料

取空白輔料適量(約相當于含枸櫞酸莫沙必利20mg)，精密稱定，置20mL量瓶中，加稀釋液超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，依法測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。由結(jié)果可知，空白輔料對本品有關(guān)物質(zhì)檢查無干擾。

2.4 峰定位

精密稱取枸櫞酸莫沙必利原料、雜質(zhì)A、B、C對照品各約5mg，置50mL量瓶中，加稀釋液超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取0.5mL，置20mL量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，作為峰定位溶液，依法測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，莫沙必利與相鄰雜質(zhì)及雜質(zhì)之間的分離度均達到要求。莫沙必利及雜質(zhì)A、B、C的保留時間(RT)和相對保留時間(RRT)等見表2。

表2 峰定位與系統(tǒng)適用性試驗結(jié)果Tab.2 Test results of Peak location and system applicabilit

2.5 強制降解試驗

按如下方法分別對枸櫞酸莫沙必利分散片和空白輔料進行強制降解試驗。

2.5.1 酸破壞

取樣品細粉適量(約相當于枸櫞酸莫沙必利20mg)，精密稱定，置20mL量瓶中，加稀釋液5mL溶解，再加1mol/L-1鹽酸溶液5mL，95℃水浴加熱30min，冷卻，用1mol/L的NaOH溶液5mL中和，用稀釋液稀釋至刻度，搖勻，濾過。

2.5.2 堿破壞

取樣品細粉適量(約相當于枸櫞酸莫沙必利20mg)，精密稱定，置20mL量瓶中，加稀釋液5mL溶解，再加1mol/L NaOH溶液5mL，95℃水浴加熱30min，冷卻，用1mol/L鹽酸溶液5mL中和，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，濾過。

2.5.3 氧化破壞

取樣品細粉適量(約相當于枸櫞酸莫沙必利20mg)，精密稱定，置20mL量瓶中，加稀釋液5mL溶解，再加3%H2O2溶液5mL，95℃水浴加熱10min，冷卻，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，濾過。

2.5.4 高溫破壞

取樣品細粉適量(約相當于枸櫞酸莫沙必利20mg)，精密稱定，置20mL量瓶中，置105℃烘箱中加熱12h，用稀釋液超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過。

2.5.5 光破壞

取在4500Lx光照箱中放置5天樣品適量(約相當于枸櫞酸莫沙必利20mg)，精密稱定，置20mL量瓶中，加稀釋液超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過。

精密量取上述破壞溶液，分別依法測定，記錄色譜圖(圖3-圖7)，考察主成分峰純度、與降解雜質(zhì)分離度和降解雜質(zhì)峰歸屬(RRT)、最大吸收波長以及物料守恒。結(jié)果表明，各強制降解條件下，主峰峰純度、與相鄰雜質(zhì)的分離度均符合要求；本品對堿、光均不敏感，氧化破壞產(chǎn)生雜質(zhì)C(莫沙必利N-氧化物)；而熱破壞主要產(chǎn)生雜質(zhì)B(莫沙必利檸檬酰胺)、雜質(zhì)C；主成分及各降解雜質(zhì)的最大吸收波長均在274nm波長左右；通過計算，各破壞條件下稱樣量/總峰面積與未破壞時稱樣量/總峰面積的比值基本一致，且物料守恒。說明本方法能有效的檢出各降解雜質(zhì)，專屬性強。

圖1 空白輔料Fig. 1 blank excipient

圖2 峰定位Fig. 2 Peak location

圖3 酸降解Fig. 3 Acid degradation

圖4 堿降解Fig. 4 Alkali degradation

圖5 氧化降解Fig. 5 Oxidative degradation

圖6 高溫降解Fig. 6 High temperature degradation

圖7 光照降解Fig. 7 Photodegradation

2.6 檢測波長的確定

由雜質(zhì)A、B、C以及強制降解試驗中各降解雜質(zhì)的光譜圖可知，在274nm波長處均有較大吸收，而莫沙必利的最大波長為274nm，故選擇274nm作為本品有關(guān)物質(zhì)檢查的檢測波長[6]。

2.7 已知雜質(zhì)研究

2.7.1 線性關(guān)系與范圍

取枸櫞酸莫沙必利、雜質(zhì)A、B、C對照品各10.0mg，精密稱定，置100mL量瓶中，加稀釋液超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液；精密量取0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL，分別置20mL量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻；精密量取各10μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以濃度C(μg/mL-1)為橫坐標，峰面積A為縱坐標進行線性回歸。結(jié)果見表3。

表3 枸櫞酸莫沙必利與各雜質(zhì)的線性關(guān)系及檢測限與定量限結(jié)果Tab.3 Linear relationship , detection limit and quantitative limit results of mosapride citrate and impurities

2.7.2 定量限

以信噪比(S/N)為10∶1的濃度為最低定量限溶液，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果表明，莫沙必利和雜質(zhì)A、B1、B2、C的保留時間的RSD分別為0.07%、0.13%、0.17%、0.20%、0.10%；莫沙必利和雜質(zhì)A、B、C的峰面積的RSD分別為1.76%、2.09%、2.41%、2.48%。

2.7.3 檢測限

以信噪比(S/N)為3∶1的濃度為最低檢測限溶液，進樣10μl，記錄色譜圖。結(jié)果見表3。

2.7.4 校正因子

采用線性與范圍試驗項下枸櫞酸莫沙必利標準曲線的斜率與各雜質(zhì)標準曲線的斜率之比計算各雜質(zhì)相對枸櫞酸莫沙必利的校正因子，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，雜質(zhì)A和雜質(zhì)B的校正因子均在0.9～1.1范圍之外，須用主成分自身對照法計算含量；而雜質(zhì)C可直接用主成分自身對照法計算含量。

表4 已知雜質(zhì)校正因子試驗結(jié)果Tab.4 Test results of known impurity correction factors

2.7.5 精密度

精密量取“2.7.1”項下的對照品儲備液1.0mL，置20mL量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，作為100%(5μg/mL-1)濃度溶液。同法配制80%(4μg/mL-1)和120%(6μg/mL-1)濃度溶液，每個濃度配制3份。精密量取上述三種溶液各10μl，，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積。結(jié)果表明，在80%(4μg/mL-1)、100%(5μg/mL-1)和120%(6μg/mL-1)三個濃度范圍內(nèi)，莫沙必利峰面積的RSD分別為0.89%、0.70%、0.80%，雜質(zhì)A峰面積的RSD分別為0.77%、0.33%、0.88%，雜質(zhì)B峰面積的RSD分別為0.84%、0.70%、0.98%，雜質(zhì)C峰面積的RSD分別為0.72%、0.39%、0.74%。說明本方法重復性較好。

2.7.6 中間精密度

取本品樣品(批號：130801)和雜質(zhì)對照品溶液，由不同試驗員在不同的時間用不同儀器，分別依法測定6份，按外標法以峰面積計算已知雜質(zhì)的含量，計算RSD，考察本方法的重現(xiàn)性。結(jié)果表明，雜質(zhì)A、B、C含量的RSD分別為6.79%、3.15%和5.82%。說明本方法重現(xiàn)性良好。

2.7.7 回收率

取本品適量(約相當于枸櫞酸莫沙必利20mg)，精密稱定，置20mL量瓶中，加入“2.7.1”項下的對照品儲備液1.0mL，用稀釋液超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為100%濃度的供試品溶液，同法配制80%濃度的供試品溶液和120%濃度的供試品溶液，每個濃度配制3份；另取“2.7.1”項下的對照品儲備液1.0mL，置20mL量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為對照品溶液；另取本品適量(約相當于枸櫞酸莫沙必利20mg)，精密稱定，置20mL量瓶中，用稀釋液超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為空白校正溶液。精密量取供試品溶液、對照品溶液和空白校正溶液各10l，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，用空白校正溶液校正后，按外標法以峰面積計算各雜質(zhì)的含量，計算回收率和相對標準偏差(RSD)。結(jié)果表明，雜質(zhì)A、B、C的平均回收率分別為98.53%、99.01%和101.28%，RSD分別為1.14%、0.98%和1.65%。表明本法的回收率良好。

2.8 溶液穩(wěn)定性

精密量取對照品溶液和供試品溶液，室溫放置，分別于配制后0、2、4、6、8h取樣測定，通過對照品峰面積和有關(guān)物質(zhì)(按面積歸一化法計算)的變化情況的變化情況，考察溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，對照品溶液中莫沙必利和雜質(zhì)A、B、C峰面積的RSD分別為 0.51%、0.63%、0.60%和0.55%；供試品溶液中雜質(zhì)A、B、C、其他雜質(zhì)之和及總雜的含量分別為0.01%、0.07%、0.07%、0.18%和0.33%，基本上沒有變化。說明對照品溶液及供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 耐用性

在本方法色譜條件的基礎上，分別改變流速(0.8mL · mi-n和1.2mL · mi-n)、柱溫(35℃和45℃)、檢測波長(269和279nm)、流動相pH值(3.8和4.2)和色譜柱(Agilent XDB-C18)，取供試品溶液和系統(tǒng)適用性溶液，每個條件進樣3次，考察本實驗的耐用性。結(jié)果表明，莫沙必利和雜質(zhì)A、B、C的保留時間、柱效、對稱性和分離度均符合要求，且雜質(zhì)A、B、C和其他單雜、總雜均無顯著性差異(RSD≤10)。

2.10 樣品有關(guān)物質(zhì)測定

表5 有關(guān)物質(zhì)檢查外標法與自身對照法比較結(jié)果Tab.5 Comparison of the results of external standard method and self-control method for related substance examinatio

取本品三批樣品(批號：130801、130802、130803)，分別采用加校正因子的主成分自身對照法(A法)和外標法(B法)計算樣品中已知雜質(zhì)的含量，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，加校正因子的主成分自身對照法和外標法測定已知雜質(zhì)結(jié)果基本一致，且均符合規(guī)定。為方便檢測，本實驗采用加校正因子的主成分自身對照法檢查本品的有關(guān)物質(zhì)。

3 結(jié)論

3.1 相對保留時間(RRT)

本方法采用相對保留時間對已知雜質(zhì)進行定位，通過線性與范圍試驗、精密度試驗和回收率試驗中各已知雜質(zhì)保留時間與莫沙必利保留時間的比值，確定了雜質(zhì)A、B、C的相對保留時間[7,8]；同時，本方法指定了Welch SX-C8色譜柱為本品有關(guān)物質(zhì)檢查專用色譜柱。

3.2 校正因子

根據(jù)《藥品雜質(zhì)分析指導原則》，雜質(zhì)的校正因子在“0.9～1.1”之內(nèi)的，可直接采用主成分的自身對照法對雜質(zhì)進行定量；超出此范圍，而在“0.2～5.0”之內(nèi)的，可采用加校正因子的主成分的自身對照法對雜質(zhì)進行定量。故雜質(zhì)A和B采用加校正因子的自身對照法計算含量，而雜質(zhì)C可直接采用主成分自身對照法進行定量。

3.3 雜質(zhì)B

雜質(zhì)B是一對映異構(gòu)體(B1和B2)，在色譜行為上表現(xiàn)為兩個峰。定位時，分別對這這兩個峰進行了定位；定量時，則將B1和B2合并為一個峰(雜質(zhì)B)以峰面積之和進行定量。

3.4 耐用性

本品對波長、柱溫、色譜柱的耐用性較好。流速為1.2mL/min時，莫沙必利N-氧化物與相鄰的雜質(zhì)峰合并成一個雜質(zhì)峰，使雜質(zhì)總數(shù)減少，但總雜沒有明顯變化，說明增大流速，不利于莫沙必利N-氧化物與相鄰雜質(zhì)峰的分離。流動相pH降低時，主峰保留時間減小，不利于主峰與相鄰雜質(zhì)的分離。