饒毅 徐先棟 王生 章海鑫 傅義龍

摘要：采用聚丙烯酰胺垂直梯度凝膠電泳法對(duì)采自贛江上游流域的吻鮈肝臟、脾臟、肌肉、腎臟、心臟和腦6 種組織中的乳酸脫氫酶和酯酶同工酶進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，吻鮈乳酸脫氫酶同工酶共檢測到3條酶帶，在肝臟、腎臟中檢測到2條，其余組織中檢測到1條。肌肉及腦組織中表達(dá)活性最高，其次為腎臟、肝臟、腎臟，心臟中表達(dá)最弱。吻鮈酯酶同工酶共檢測到5條酶帶，腎臟中檢測到5條，肝臟中檢測到4條，肌肉中3條，脾臟中2條，心臟中1條。腎臟中表達(dá)活性最高，其次為肝臟、腦、肌肉和脾臟，心臟中表達(dá)活性最弱。由結(jié)果可見吻鮈乳酸脫氫酶及酯酶分布具有組織特異性。

關(guān)鍵詞：吻鮈;乳酸脫氫酶;酯酶;組織特異性

中圖分類號(hào)：S937 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

吻鮈（Rhinogobio typus Bleeker）屬于鯉形目、鯉科、鮈亞科、吻鮈屬，我國特有種。俗稱：秋子、長鼻白楊魚、大鼓眼、鐵桿鰍和鰍兒棒[1-2]。吻鮈為底層魚類，是一種喜棲息于透明度較高、泥沙和碎石底質(zhì)的緩流河口、灣沱內(nèi)的底棲魚類，一般2～3齡達(dá)到性成熟，產(chǎn)卵在流水灘上，浮性卵，順?biāo)疀_流。主要分布于長江干流及其支流，贛江也是主要分布水系。吻鮈生長較慢，個(gè)體不大，由于其含肉率高，肉質(zhì)細(xì)嫩、營養(yǎng)豐富，必需氨基酸和鮮味氨基酸的含量高于一般的魚類，具有較高的食用價(jià)值，深受人們喜歡，市場需求旺盛，為贛江主要捕撈經(jīng)濟(jì)魚類之一。關(guān)于吻鮈的研究，主要集中在形態(tài)分類、物種分化方面以及生長和繁殖特性方面[3-5]。目前對(duì)吻鮈的種質(zhì)資源研究較少，為此，本文利用聚丙烯凝膠電泳技術(shù)研究吻鮈的乳酸脫氫酶和酯酶，為吻鮈的種質(zhì)資源利用提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

實(shí)驗(yàn)用吻鮈采自江西省峽江縣贛江水域。魚體體長約20 cm，體重90 g左右，充氧運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，并在玻璃缸中充氣暫養(yǎng)，每天投喂飼料1次，暫養(yǎng)一周后，魚狀態(tài)正常，采樣實(shí)驗(yàn)。

1.2 ?實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ?酶液提取

取吻鮈肝臟、脾臟、肌肉、腎臟、心臟和腦6 種組織少許，雙蒸水沖洗干凈，濾紙吸干表面水分，置于離心管中，按1∶3 （W/V）加入0.1 mol/L的磷酸緩沖液（pH 7.0），首先使用消毒后的手術(shù)剪把組織剪成小塊，然后再使用電動(dòng)研磨器冰浴研磨成勻漿狀。完成后于4℃下10000 r/min離心30 min，吸取上清液，-20℃儲(chǔ)存，盡快用于電泳分析。

1.2.2 ?電泳

采用垂直平板不連續(xù)聚丙烯酞胺凝膠電泳法，電泳系統(tǒng)為NuPAGE Bis-Tris蛋白預(yù)制膠套裝，包括invitrogen Mini Gel Tank 小型電泳槽，NuPAGE蛋白預(yù)制梯度凝膠（濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為12%）NuPAGE LDS Sample buffer緩沖液。20 μL樣品與2 μL指示劑溴酚蘭混合一起上樣，首先使用80 V電泳至樣品壓縮成一細(xì)線并跑出濃縮膠后，調(diào)大電壓至120 V繼續(xù)進(jìn)行分離膠電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)的邊緣到達(dá)凝膠底部時(shí)，停止電泳，整個(gè)電泳過程約30 min。

凝膠電泳完畢后立即取下，用雙蒸水漂洗干凈，置于染色液中于37℃染色，染色方法參照國標(biāo)進(jìn)行[6]，染色完成后，用雙蒸水漂洗干凈，保存于7%醋酸中。用數(shù)碼相機(jī)及伯樂（Bio-Rad）凝膠成像系統(tǒng)（Gel Doc XR+）拍攝同工酶圖譜。同工酶在各組織中的含量以條帶粗細(xì)及顏色深淺來表示，條帶粗、顏色深表示酶的含量高。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?乳酸脫氫酶酶譜表型

吻鮈乳酸脫氫酶同工酶共檢測到3條酶帶，在肝臟、腎臟中檢測到2條，其余組織中檢測到1條（圖1）。肌肉及腦組織中表達(dá)活性最高，其次為腎臟、肝臟、心臟，脾臟中表達(dá)最弱。

2.2 ? 酯酶酶譜表型

吻鮈酯酶同工酶共檢測到5條酶帶，腎臟中檢測到5條，肝臟中檢測到4條，肌肉中3條，脾臟中2條，心臟中1條（圖2）。腎臟中表達(dá)活性最高，其次為肝臟，腦，肌肉和脾臟，心臟中表達(dá)活性最弱。

3 ?討論

（1）乳酸脫氫酶（LDH）是糖酵解過程中的關(guān)鍵酶之一，在氧氣充足的組織中，如心臟中催化乳酸脫氫氧化為丙酮酸，參與三羧酸循環(huán)[7]，在厭氧器官組織中，如肝臟、肌肉組織中催化丙酮酸還原為乳酸。研究表明，魚類LDH同工酶表達(dá)是由多基因決定的，一般由M和H蛋白亞基組成，有5種組合方式，表現(xiàn)為5條酶帶，分布存在明顯的組織特異性[7-8] 。吻鮈腦組織和肌肉組織中活性強(qiáng)，因?yàn)槲酋L生活在江河流水環(huán)境，時(shí)常保持游動(dòng)狀態(tài)，與之相適應(yīng)運(yùn)動(dòng)組織肌肉和運(yùn)動(dòng)控制組織腦的酶活力強(qiáng)。此外，本次實(shí)驗(yàn)的吻鮈不同組織乳酸脫氫酶中，肌肉和腦組織中條帶表達(dá)穩(wěn)定，這兩種組織可作為吻鮈種質(zhì)鑒定的標(biāo)志酶取樣部位。

（2）酯酶（EST）屬于水解酶類，能催化酯健水解，一般認(rèn)為在硬骨魚類中EST 為單體或二聚體，由多個(gè)基因位點(diǎn)編碼，多態(tài)性現(xiàn)象普遍[9]。本研究結(jié)果也表明在吻鮈各組織中酯酶的分布具有多態(tài)性，同上述結(jié)論相似。本研究結(jié)果吻鮈中各組織酯酶表達(dá)活性也各不相同，同前人研究黃顙魚體內(nèi)酯酶結(jié)果相類似[10]。吻鮈酯酶在肝臟中表達(dá)活性最強(qiáng)，其次為腎臟。肝臟是重要的解毒器官，主要起解毒作用的就是酯酶，吻鮈肝臟中的酯酶含量豐富，與肝臟的解毒功能是相適應(yīng)的。腎臟是機(jī)體重要的排泄器官，肝臟分解的有毒有害物質(zhì)通過腎臟排出體外，因而與之相適應(yīng)其酯酶同工酶亦表現(xiàn)出活力強(qiáng)的酶帶。吻鮈肌肉組織功能想對(duì)單一，酶譜帶表達(dá)穩(wěn)定，如本研究吻鮈肌肉組織中3條酶帶，表達(dá)穩(wěn)定清晰，且具有特異性，可以作為吻鮈種質(zhì)鑒定的酯酶標(biāo)志酶取樣部位。

參考文獻(xiàn)

[1]施白南. 吻鮈的生物學(xué)[J]. 西南師范學(xué)院學(xué)報(bào)，1980，（2）：111-115.

[2]孫玉苗. 吻鮈屬（Rhinogobio） 魚類物種分化的研究[D]. 濟(jì)南：山東大學(xué)，2008.

[3]Wang X Z， Liu H Z. Phylogenetic relationships of the Chinese cyprinid genus Rhinogobio Bleeker （ Teleostei： Cyprinidae） based on sequences of the mitochondrial DNA control region，with comments on character adaptations[J]. Hydrobiologia， 2005，532（1）：215-220.

[4] Wang M， Liu F， Lin P， et al. Evolutionary dynamics of ecological niche in three Rhinogobio fishes from the upper Yangtze River inferred from morphological traits [J]. Ecol Evol， 2015，5 （3）：567-577.

[5]常劍波，孫建貽 . 嘉陵江吻鮈生長和繁殖力研究[J]. 資源開發(fā)與保護(hù)，1991，（3） ?：146 -150.

[6]GB/T 18654.13-2008 養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢驗(yàn) 第13部分：同工酶電泳分析.

[7]王鏡巖，朱圣庚，徐長法. 生物化學(xué)（第三版上冊）[M]. 高等教育出版社，2002：428-429.

[8] 徐鋼春，董晶晶，聶志娟，等. 刀鱭不同組織的乳酸脫氫酶同工酶及DNA含量研究[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，21（4）：481-488.

[9]吳少偉，張以順，黎祖福. 云斑尖塘鱧不同組織同工酶的研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（1）：136-139.

[10]李雅娟，趙興文，毛連菊，等. 黃顙魚幾種組織的組織蛋白與酯酶同工酶電泳分析[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，35（3）：342-346.