唐春麗　魏江存　陸梅元　謝臻　陳宏夏　趙鳳仙

摘要：采用回流提取法提取滿山香（Schisandra propinqua）總黃酮，通過(guò)單因素試驗(yàn)，考察提取方法、提取溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取液體積、提取時(shí)間對(duì)藥材總黃酮含量的影響，采用正交試驗(yàn)，優(yōu)化提取工藝條件，篩選出滿山香總黃酮的最佳提取工藝。結(jié)果表明，滿山香總黃酮的最佳提取工藝為60%乙醇、料液比1：40（m： V）、回流提取時(shí)間1.0 h。該方法能有效測(cè)定滿山香藥材總黃酮的含量，重復(fù)性較好、穩(wěn)定可行。

關(guān)鍵詞：滿山香（Schisandra propinqua ）;總黃酮;提取工藝

中圖分類號(hào)：R282 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114 （2020） 16-0126-04

DOI： 10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.16.028

滿山香來(lái)源于木蘭科植物合蕊五味子[Schisandrapropinqua （WaII.） Baill. var. iutermdida A. C. Smith]的干燥藤莖和根，為廣西常用藥材，具有舒筋活血、消腫止痛的功能，用于治療骨折、慢性胃腸炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛經(jīng)、外傷出血等病癥[1，2]。以滿山香為主要原料的燈銀腦通膠囊用于中風(fēng)中經(jīng)絡(luò)、瘀血阻絡(luò)的治療。目前，野生滿山香植物資源種群稀少，蘊(yùn)藏量小[3];瑤藥滿山香含有木脂素類[4-6]、黃酮類[7，8]、揮發(fā)性[1]等成分。黃酮類化合物是廣譜生物活性物質(zhì)，普遍存在于植物中，具有抗癌、防癌、抑菌、抗病毒、降低膽固醇等藥理作用與生物活性，以及對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)[9]和免疫系統(tǒng)等有很好的保護(hù)作用[10-13]。

本研究以瑤藥滿山香總黃酮含量為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)考察了提取方法、提取溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取液體積、提取時(shí)間對(duì)提取滿山香藥材總黃酮含量的影響，并采用正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)選最佳提取工藝，為進(jìn)一步研究滿山香藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了一定的參考依據(jù)。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)滿山香藥材總黃酮含量測(cè)定的相關(guān)研究鮮見(jiàn)報(bào)道，為保證其藥材質(zhì)量及臨床療效，本試驗(yàn)建立滿山香總黃酮的含量測(cè)定方法，為后期開發(fā)、利用其藥用資源提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器

UV1780型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）;XS105D型十萬(wàn)分之一天平（梅特勒-托利多稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司）;KQ5200B超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）;數(shù)顯電子恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）;優(yōu)普ULUPURE實(shí)驗(yàn)室超純水儀（上海優(yōu)普實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 材料

蘆丁，純度>98%，購(gòu)于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司;甲醇、乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等所用試劑均為分析純。藥材采摘于廣西賀州市富川瑤族自治縣，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳勇教授鑒定為木蘭科植物合蕊五味子，經(jīng)52 ℃烘干，備用。

1.3 方法

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取105 ℃干燥到恒重的蘆丁對(duì)照品適量，加60%乙醇溶解，定容至25 mL容量瓶中，搖勻，制成濃度為0.4482 mg/mL的對(duì)照品溶液。

1.3.2 供試品溶液制備 精密稱取瑤藥滿山香藥材粉末1.0 g，置于100 mL的錐形瓶中，加入25 mL體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，稱定其重量，水浴回流提取1.0 h，再稱定重量，使用60%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液2.0 mL，置于50 mL容量瓶中，依據(jù)總黃酮的測(cè)定方法測(cè)定其吸光度，用線性方程求出樣品溶液中總黃酮的含量，計(jì)算得到滿山香藥材總黃酮含量。

1.3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 精密量取上述對(duì)照品溶液3 mL于25 mL容量瓶中，再加入1mL的5%亞硝酸鈉溶液，輕輕搖勻，靜置6 min后加入1 mL的10%硝酸招溶液，搖勻，靜置6 min，再加4%氫氧化鈉溶液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置12 min，以相應(yīng)試劑作空白，采用分光光度法在400～800 nm測(cè)定吸收光譜，其最大吸收波長(zhǎng)為512 nm。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別取“ 1.3.1”的對(duì)照品溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0mL 于 25 mL 容量瓶中，加5%亞硝酸納0.4 mL，放置6 min后，加10%硝酸鉛0.4 mL，放置6 min，再加4%的氫氧化鈉4mL，加水至刻度，搖勻，放置10 min，然后在512 nm測(cè)定[18]。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

1） 提取方法。取滿山香藥材粉末1.Og，精密稱定，置于錐形瓶中，提取時(shí)間1 h、25 mL、60%乙醇為提取條件，分別采用超聲提取法、回流提取法和浸漬法對(duì)藥材進(jìn)行總黃酮提取，考察不同提取方法對(duì)滿山香總黃酮提取率的影響。

2） 乙醇溶劑體積分?jǐn)?shù)。取藥材粉末1.Og，精密稱定，置于錐形瓶中，提取時(shí)間1.0 h、25 mL不同體積分?jǐn)?shù)（30%、50%、60%、70%和85%）的乙醇溶劑為提取條件，采用回流提取法，分析乙醇溶劑不同體積分?jǐn)?shù)對(duì)藥材總黃酮提取率的影響。

3） 提取時(shí)間。取藥材粉末1.Og，精密稱定，置于錐形瓶中，以60%乙醇25 mL為提取條件，采用回流提取法，分析提取時(shí)間對(duì)藥材總黃酮提取率的影響，設(shè)提取時(shí)間為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h。

4） 提取液體積。取藥材粉末1.Og，精密稱定，置于錐形瓶中，提取時(shí)間1h、60%乙醇為提取條件，采用回流提取法，分析乙醇不同體積對(duì)藥材總黃酮提取率的影響，設(shè)計(jì)60%乙醇提取體積分別為20、30、40、50、60、70 mL。

以上單因素試驗(yàn)按“1.3.2”的操作步驟制備供試品，按“1.3.3”的方法顯色測(cè)定。

1.3.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 從中藥滿山香中提取藥材總黃酮的方法主要為有機(jī)溶劑提取法。根據(jù)查閱的相關(guān)文獻(xiàn)[14-17]，本試驗(yàn)最終采取不同體積分?jǐn)?shù)乙醇為溶劑的提取方法，根據(jù)單因素考察結(jié)果，設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%）、料液比（1：30、1：40、1：50，m：V，下同）、提取時(shí)間（1.0、1.5、2.0 h）這3個(gè)條件。根據(jù)正交設(shè)計(jì)助手軟件，使用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。

2結(jié)果與分析

2.1 線性方程的制定

以吸光度對(duì)蘆丁溶液濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為y=13.042x-0.038 5，R2=0.999 1，在0.008964～?0.071712 mg/mL濃度與吸光度有良好的線性關(guān)系。

2.2方法學(xué)考察

2.2.1 精密度試驗(yàn) 精密稱取滿山香藥材粉末1.0g，按“1.3.2”的操作步驟制備供試品，按“1.3.3”的方法顯色測(cè)定。于512 nm波長(zhǎng)下連續(xù)6次測(cè)定其吸光度，結(jié)果為1.06%，小于3.00%，表明該方法精密度良好。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取滿山香藥材粉末1.0 g，精密稱定，按照“1.3.2”的操作步驟制備供試品，按“1.3.3的方法顯色測(cè)定，測(cè)定同一供試液在不同時(shí)間下的吸光度，于512 nm波長(zhǎng)處分別在0、10、20、30、40、50、60 min測(cè)定吸光度，計(jì)算藥材的RSD值為2.41%，小于3.00%，吸收度在60 min內(nèi)基本不變，表明樣品在60 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取瑤藥滿山香藥材粉末樣品6份，每份約1.0 g，按“1.3.2”的操作步驟制備供試品，按“1.3.3”的方法顯色測(cè)定。于512 nm波長(zhǎng)處平行測(cè)定其吸光度，計(jì)算滿山香藥材總黃酮的平均含量為 22.78 mg/g，RSD 值為 2.79%，小于 3.00%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批次已知總黃酮含量的滿山香藥材粉末（含量為22.78 mg/g）0.5 g，精密稱定，共9份，分成3組，即低、中、高加樣組（0.5 g藥材總黃酮含量的80%、100%和120%加樣，精密加入蘆丁對(duì)照品，加樣量分別為9.20、11.40、13.65mg），按“1.3.2”的操作步驟制備供試品，按“1.3.3”的方法顯色測(cè)定。于512 nm波長(zhǎng)處平行測(cè)定其吸光度，計(jì)算總黃酮的含量。由試驗(yàn)結(jié)果分析可知，滿山香藥材的低、中、高加樣組總黃酮的平均回收率分別為 98.78%、100.56%、99.40%，RSD分別為 2.59%、2.04%、2.93% （n=3），表明該方法準(zhǔn)確性良好，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖1可知，不同提取方法對(duì)滿山香總黃酮提取率的影響中，回流提取法的提取率最高，故而選擇回流提取進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。由圖2可知，60%乙醇回流提取滿山香葉總黃酮的提取率最高。不同提取時(shí)間對(duì)滿山香總黃酮提取率的影響結(jié)果（圖3）表明，提取時(shí)間為1.5 h時(shí)，總黃酮提取率最高。由圖4可知，結(jié)果顯示提取液體積為40 mL時(shí)，滿山香總黃酮提取率最高。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4.1 正交試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)正交設(shè)計(jì)助手軟件、正父試驗(yàn)結(jié)果（表3）和方差分析結(jié)果（表4）可知，以瑤藥滿山香總黃酮的含量為試驗(yàn)指標(biāo)，由于各試驗(yàn)因素對(duì)滿山香藥材總黃酮提取效果的影響程度不同，乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對(duì)滿山香總黃酮的提取工藝有顯著影響，而提取時(shí)間對(duì)滿山香總黃酮的提取工藝無(wú)顯著影響，且各影響因素的大小順序?yàn)榱弦罕龋?）>乙醇體積分?jǐn)?shù)（4）>提取時(shí)間（C），考慮試驗(yàn)的效率、時(shí)間以及成本，故而選擇提取時(shí)間為l.Oh，因此，本試驗(yàn)最理想的提取方案是，即乙醇體積分?jǐn)?shù)是60%，料液比是1：40，回流提取時(shí)間是1.0 h，此時(shí)提取效果最佳。2.4.2驗(yàn)證試驗(yàn)精密稱取滿山香藥材粉末3份，每份約1.0 g，置于錐形瓶中，測(cè)定其總黃酮含量，結(jié)果（表5）表明，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化的工藝提取滿山香藥材總黃酮，其含量平均值為23.53 mg/g，/^D為1.94%〇

3小結(jié)與討論

本試驗(yàn)以滿山香藥材為研究對(duì)象，考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取液體積和提取時(shí)間3個(gè)影響因素，瑤藥滿山香總黃酮的提取采用回流提取法，利用正交試驗(yàn)的方法優(yōu)化瑤藥滿山香總黃酮的最佳提取工藝。前期研究發(fā)現(xiàn)，影響瑤藥滿山香總黃酮提取工藝的主要因素是溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取液體積和提取時(shí)間，根據(jù)試驗(yàn)影響因素的選擇與確定，本試驗(yàn)采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法，進(jìn)行多次試驗(yàn)，結(jié)果分析表明，瑤藥滿山香的最佳提取工藝，即采用回流提取法，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，料液比為1：40，提取時(shí)間為1.0 h，此時(shí)瑤藥滿山香總黃酮提取效果最佳。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)，建立了滿山香總黃酮提取率的工藝優(yōu)化。方差分析表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比2個(gè)因子具有顯著性，各因子對(duì)總黃酮含量影響的大小依次為料液比（B）>乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）>提取時(shí)間（C）。

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收稿日期：2019-11-15

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81360524） ;2019年度廣西高校中青年教師科研基礎(chǔ)能力提升項(xiàng)目（2019KY0341）;廣西中醫(yī)藥大學(xué)青年基金項(xiàng)目（2019QN036）;廣西然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014GXNSFAA118208）;國(guó)家中醫(yī)藥管理局科研三級(jí)實(shí)驗(yàn)室中（壯）藥化學(xué)與質(zhì)量分析實(shí)驗(yàn)室（國(guó)中醫(yī)藥發(fā)2009[21]號(hào)）

作者簡(jiǎn)介：唐春麗（1980-），女，廣西桂平人，副主任藥師，碩士，主要從事中藥質(zhì)量分析及其藥效機(jī)制研究，（電話）18978913964（電子信箱）12072982891@qq.com;通信作者，魏江存，藥師，碩士，主要從事中藥、民族藥及其制劑質(zhì)量分析和藥效機(jī)制研究，（電子信箱）960837714@qq.com。