盧苑青　張騰飛　邵華斌　曾馳

摘要：凝固酶陰性葡萄球菌是廣泛存在于自然界中的一種革蘭氏陽(yáng)性條件致病菌，畜禽養(yǎng)殖舍是其病原體傳播的一個(gè)重要傳染源，但其在家禽舍氣溶膠中的流行情況和特征并不明確。通過(guò)對(duì)從家禽養(yǎng)殖舍生物氣溶股采集而來(lái)的細(xì)菌進(jìn)一步分離鑒定，共獲得了 102株凝固酶陰性葡萄球菌（coagulase-negativestaphyolcocci，CoNS），其中松鼠葡萄球菌（41.18%）是最主要的菌種，此外還包括馬胃葡萄球菌（21.57%）、腐生葡萄球菌（18.63%）、溶血葡萄球菌（10.78%）、木糖葡萄球菌（5.88%）等。耐藥性分析結(jié)果顯示，分離的葡萄球菌對(duì)青霉素、氨芐西林、環(huán)丙沙星、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素、克林霉素和苯唑西林均呈現(xiàn)高耐藥率。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，有36.3%的菌株攜帶有耐藥基因mecA，且均對(duì)苯唑西林耐藥，而mecA是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的標(biāo)志耐藥基因。

關(guān)鍵詞：家禽舍;氣溶股;凝固酶陰性葡萄球菌（coagulase-negative staphylccocci，CoNS）;耐藥性;mecA

中圖分類號(hào)：S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020） 16-0118-04

D0I：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.16.026

凝固酶陰性葡萄球菌（coagulase-negative Staph-ylococci，CoNS）是一類條件致病菌，廣泛存在于粉塵、土壤、水源和空氣中[1]。CoNS可以導(dǎo)致人類和禽類患病，在人群中，它是重要的感染病原體，常可引發(fā)心內(nèi)膜炎或敗血癥[2，3];在家禽中，CoNS的感染可以引起關(guān)節(jié)炎、纖維蛋白性瞼緣炎及全身性感染。另外，耐甲氧西林的凝固酶陰性葡萄球菌（methicillin-resistant coagulase-negative Staphylococ-ci，MRCoNS）導(dǎo)致雞肉污染的報(bào)道也常有發(fā)生，顯示出該細(xì)菌食源性傳播的可能性[4，5]。

有關(guān)抗生素的濫用、多重耐藥的葡萄球菌報(bào)道激增[6]，耐藥性的增加同樣限制了治療時(shí)的藥物選擇。同時(shí)，葡萄球菌廣泛存在于如醫(yī)院、畜牧場(chǎng)等抗生素濫用的地方，從而進(jìn)一步加劇了細(xì)菌對(duì)耐藥性基因的獲取[7，8]。耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（methicillin一resistant Staphylococcus aureus，MRSA）及耐萬(wàn)古霉素的金黃色葡萄球菌（vancomycin-resis-tant S. aureus，VRSA）被大量報(bào)道，這些細(xì)菌與CoNS攜帶為相似的基因，如耐甲氧西林的mecA[9]。CoNS因其可在空氣中傳播的性質(zhì)，有可能成為這些抗性基因擴(kuò)散的源頭，而這也嚴(yán)重威脅到公共衛(wèi)生安全。

空氣傳播是細(xì)菌與病毒在家禽養(yǎng)殖舍中傳播的重要途徑，禽舍空氣主要包括細(xì)菌、病毒、霉菌以及其組成物如內(nèi)毒素，這些都是動(dòng)物和人類感染的潛在致病源。對(duì)瑞士12個(gè)養(yǎng)殖舍的分析指出，養(yǎng)殖舍中細(xì)菌暴露的平均水平在5.3×108個(gè)/m3，而其中6.2×107個(gè)/m3都是葡萄球菌表明除了動(dòng)物糞便及污水，雞舍中空氣對(duì)動(dòng)物和人類的健康安全也可造成潛在威脅，是向環(huán)境中傳播病原體和致病基因的重要途徑。在加拿大，腸球菌、大腸桿菌和葡萄球菌是養(yǎng)殖舍中傳播最廣泛的3個(gè)菌群，并在生物氣溶膠中發(fā)現(xiàn)了很高水平的耐桿菌肽鋅、紅霉素、四環(huán)素的基因[11]。對(duì)MRCoNS攜帶的耐藥基因鑒定表明，當(dāng)人接觸了攜菌動(dòng)物時(shí)，很有可能被MRCoNS傳染從而獲得耐藥基因存在于葡萄球菌的盒式移動(dòng)元件SCCmec中，耐甲氧西林的抗性決定簇（即mec決定簇）在葡萄球菌種之間是可自由傳播的，廣泛分布在金黃色葡萄球菌和CoNS之間[12，13]，是導(dǎo)致耐甲氧西林葡萄球菌大量存在的主要原因。本研究探究雞舍空氣中葡萄球菌的流行情況及耐藥性情況，為禽舍的養(yǎng)殖提供指導(dǎo)，并以此為基礎(chǔ)為下一步驗(yàn)證耐藥基因在不同種屬葡萄球菌之間的傳播性打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 菌株

研究所用菌株大腸桿菌ATCC 25922和金黃色葡萄球菌ATCC 25923均來(lái)自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院畜牧獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑與儀器

BioSampler采樣器購(gòu)于美國(guó)SKC公司，2×RTaq MasterMix購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司，Muel-ler-Hinton Agar、Mueller-Hinton Broth、Tryptic SoyAgar、Tryptic Soy Broth 購(gòu)于美國(guó) BD 公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)菌的培養(yǎng)與鑒定 2017年4月至7月及2018年期間，從華中地區(qū)9家雞舍空氣中采集了樣品，以監(jiān)控雞舍養(yǎng)殖過(guò)程中細(xì)菌的變化情況。樣品的采集時(shí)間為換籠期前的最初90 d生長(zhǎng)期。根據(jù)中國(guó)室內(nèi)空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（GB/T18883—2002）選取5個(gè)均勻分布在雞舍的采樣點(diǎn)采集了生物氣溶膠。將氣溶膠收集到20 mL PBS溶液中，保存于冰浴中50mL無(wú)菌離心管中，然后立即轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離。使用Tryptic Soy Agar平板對(duì)收集到的細(xì)菌進(jìn)行純化培養(yǎng)，挑選出疑似的葡萄球菌菌落，并使用16 S rRNA序列分析和微生物鑒定系統(tǒng)Phoenix-100進(jìn)行鑒定。純化后的菌液與60%甘油1：1混合置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Bitrus等[14]的方法設(shè)計(jì)合成了16SrRNA通用引物及mecA，擴(kuò)增長(zhǎng)度分別為1 500J63 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列分別為：16SF：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，16SR：5'GGTTACCTTGTTACGACTT-3';mecAF：5'-ACTGCTATCCACCCTCAAAC-3'，mecAR：5'-CTGGTGAAGTTGTAATCTG-3'。

1.3.3 模板制備及PCR擴(kuò)增 將疑似葡萄球菌劃線接種于TSA平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)得到純化后的單菌落，挑單菌落溶于200 μLddH2O中，煮沸15min后置于冰上15 min，13 000 r/min離心4 min，取上清液作為PCR模板。

PCR反應(yīng)擴(kuò)增反應(yīng)總體系為25 μL，包括：2×Es Taq MasterMix 12.5μL （包括 Es Taq DNA Poly-merase， 2×Es Taq PCR Buffer， 3 mmol/L MgCl2， 400μmol/L dNTP mix），DNA 模板 2 μL，上、下游引物各1 μL，滅菌去離子水8.5 μL。PCR擴(kuò)增的條件均為94℃預(yù)變性 5 min;94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 1 min，72℃延伸5min，共35個(gè)循環(huán);72℃延伸5min。配置1%瓊脂糖凝膠（mecA條帶電泳時(shí)需配置2%瓊脂糖凝膠），取5μLPCR產(chǎn)物加樣，140V電壓電泳15min，DNA譜帶用嗅化乙錠染色，并使用GelDocXR系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）拍照、分析結(jié)果。

將16S rRNA PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，BLAST驗(yàn)證細(xì)菌是否為葡萄球菌;觀察163 bp處有無(wú)特異性條帶出現(xiàn)，若有則可判斷該細(xì)菌中存在耐藥基因mecA。

1.3.4 藥物敏感性試驗(yàn) 將分離得到的葡萄球菌使用紙片擴(kuò)散法或最小抑菌濃度（minimum inhibitoryconcentration，MIC）測(cè)定法測(cè)試其對(duì)不同抗生素的敏感性。根據(jù)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）的操作要求，將藥敏片放置于涂布了葡萄球菌菌液的Mueller-Hinton瓊脂（MHA）平板表面，37 ℃下培養(yǎng)24 h。藥敏片包括青霉素、氨芐西林、環(huán)丙沙星、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素、阿米卡星、利福平和克林霉素。按照CLSI文件測(cè)量并分析抑菌圈直徑。

對(duì)不適合使用藥敏片的抗菌藥物進(jìn)行MIC試驗(yàn)，以確定葡萄球菌對(duì)苯唑西林（根據(jù)CLSI文件，用于確認(rèn)其對(duì)甲氧西林的耐藥性）和萬(wàn)古霉素的耐藥性，評(píng)估濃度為苯唑西林為0.125～128 μg/mL，萬(wàn)古霉素為0.125～6 μg/mL。該試驗(yàn)使用大腸桿菌ATCC 25922和金黃色葡萄球菌ATCC 25923菌株作為質(zhì)控菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌種屬鑒定分析

對(duì)從雞舍空氣中收集的細(xì)菌進(jìn)行分析，細(xì)菌總數(shù)隨著養(yǎng)殖時(shí)間的推移而增加，到后期絕大部分細(xì)菌為葡萄球菌。通過(guò)16SrRNA分析可知，共有102株凝固酶陰性為葡萄球菌，CoNS是其中的主要屬，其結(jié)果如表1所示。松鼠葡萄球菌是最主要菌種，占全部CoNS的41.18%，其次是馬胃葡萄球菌和腐生葡萄球菌，分別為21.57%及18.63%，除此之外還有溶血葡萄球菌（10.78%）、木糖葡萄球菌（5.88%）、阿爾萊特葡萄球菌（0.98%）、雞葡萄球菌（0.98%）等。

2.2耐約基因檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)對(duì)102株葡萄球菌耐藥基因的擴(kuò)增鑒定，mecA陽(yáng)性及陰性結(jié)果如表1所示。攜帶有mecA基因的葡萄球菌共有37株，陽(yáng)性率為36.27%，其中松鼠葡萄球菌中有71.43%攜帶有耐藥基因，另外在馬胃葡萄球菌、木糖葡萄球菌和雞葡萄球菌中也有mecA的陽(yáng)性菌株，陽(yáng)性率分別為18.18%、33.33%、100%。

2.3 葡萄球菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

用紙片擴(kuò)散法檢測(cè)102株葡萄球菌對(duì)9種抗生素的敏感性結(jié)果如圖1所示。菌株對(duì)廣泛應(yīng)用于動(dòng)物養(yǎng)殖中的抗生素耐藥率較高，分別為青霉素（69.61 %）、氨芐西林（58.82%）、環(huán)丙沙星（66.67%）、氯霉素（93.14%）、紅霉素（48.04%）、四環(huán)素（91.18%）和克林霉素（45.10%）。相比之下因在養(yǎng)殖中的應(yīng)用較少，阿米卡星（6.86%）和利福平（20.59%）的耐藥率較低。與mecA陰性菌株相比，mecA陽(yáng)性菌株對(duì)青霉素、氨芐西林和環(huán)丙沙星的耐藥率較高，對(duì)紅霉素和克林霉素的耐藥率較低。

苯唑西林和萬(wàn)古霉素這兩種重要抗生素的敏感性則通過(guò)MIC檢測(cè)（表2），有49.0%菌株苯唑西林的MIC值大于2 μg/mL，40.2%菌株萬(wàn)古霉素的MIC值在4～8 μg/mL，為中等水平;在mecA陽(yáng)性菌株中，100%的菌株苯唑西林MIC值大于2 μg/mL，而在mecA陰性菌株中只有20%苯唑西林MIC值大于2 μg/mL，與陽(yáng)性菌株相比有較大差異，陽(yáng)性菌株對(duì)苯唑西林的耐藥率較高。

3小結(jié)與討論

從雞舍空氣氣溶膠中分離出了102株葡萄球菌，對(duì)葡萄球菌進(jìn)一步鑒定得知，它們都屬于凝固酶陰性葡萄球菌。通過(guò)對(duì)菌株mecA基因的鑒定，36.27%的CoNS攜帶有抗性基因mecA。由于在養(yǎng)殖過(guò)程中抗生素的大量使用，細(xì)菌對(duì)部分抗生素如氯霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星等耐藥率較高，而對(duì)養(yǎng)殖過(guò)程中不常使用的抗生素如阿米卡星和利福平則耐藥率較低，針對(duì)甲氧西林和萬(wàn)古霉素兩種不適用紙片擴(kuò)散法的藥物，MIC試驗(yàn)結(jié)果顯示，mecA陽(yáng)性菌株對(duì)苯唑西林的MIC值均大于2 μg/mL，明顯高于mecA陰性菌株。

近年來(lái)，禽類規(guī)模化養(yǎng)殖變得越來(lái)越普遍，但環(huán)境與公共健康問(wèn)題也隨之而來(lái)，生物氣溶膠是其中重要的一部分。通過(guò)跟蹤養(yǎng)殖舍不同周期的空氣中微生物的含量，發(fā)現(xiàn)其濃度隨著家禽日齡的增長(zhǎng)而增長(zhǎng)，其中葡萄球菌這一潛在致病菌顯著增加。氣溶膠中存在著大量不同種類的細(xì)菌，如芽孢桿菌、假單胞菌、大腸桿菌、葡萄球菌及鏈球菌等，就本研究中葡萄球菌來(lái)說(shuō)，本是一種條件致病菌，但由于近年來(lái)抗生素的大量使用，使一部分葡萄球菌獲得了耐藥性，給禽類養(yǎng)殖及臨床用藥都帶來(lái)了一定的影響，隨著氣溶膠擴(kuò)散傳播，也給在養(yǎng)殖舍工人帶了健康威脅。

通過(guò)對(duì)收集的102株葡萄球菌進(jìn)一步探究，了解它們的種屬，在對(duì)其進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)時(shí)，部分菌株表現(xiàn)出了耐藥現(xiàn)象，甚至有些菌株為多重耐藥菌株，警示對(duì)抗生素的使用應(yīng)更加謹(jǐn)慎。另外，通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)有無(wú)mecA基因進(jìn)行的驗(yàn)證顯示，有36.3%的葡萄球菌都攜帶該基因，對(duì)苯唑西林亦有耐藥性（MIC≥2 μg/mL）。相關(guān)文獻(xiàn)[15]報(bào)道攜帶有耐藥基因的CoNS成為耐藥基因的儲(chǔ)存庫(kù)和傳播源，以上結(jié)果顯示，養(yǎng)殖舍氣溶膠中的CoNS不僅對(duì)養(yǎng)殖業(yè)有不利影響，也會(huì)威脅公共健康安全，本研究揭示了葡萄球菌在家禽養(yǎng)殖過(guò)程中產(chǎn)生的不利影響，由于其傳播性，其危害不僅針對(duì)禽類，也對(duì)雞舍工人的健康造成威脅。本研究給深入研究家禽養(yǎng)殖過(guò)程中CoNS的流行性及耐藥性提供依據(jù)和基礎(chǔ)的同時(shí)，也揭示研究其所攜帶耐藥基因傳播性的必要性與緊迫性。

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收稿日期：2020-01-14

基金項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助項(xiàng)目（nycytx-41-G13）

作者簡(jiǎn)介：盧苑青（1994-），女，山東東營(yíng)人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)榍菁?xì)菌病的流行病學(xué)，（電話）17671647921 （電子信箱）wanylu@out-look.com;通信作者，張騰飛，副研究員，（電子信箱）tfzhang23@ 163.com。