賀小剛，阿迪拉·阿布都熱西提，庫爾班江·努爾麥提，努爾比耶·阿卜杜瓦柯，韓 想，馮昱龍，楚剛輝

(新疆特色藥食用植物資源化學實驗室，喀什大學 化學與環(huán)境科學學院，新疆 喀什 844000)

木犀草素(Luteolin)是一種常見的天然黃酮類化合物，存在于多種植物中，具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒等多種生理活性，富含木犀草素的藥物常用于治療疾病[1-3]。目前，木犀草素常見的檢測方法有高效液相色譜法(HPLC)[4-5]、反相高效液相色譜法(RP-HPLC)[6]、高效液相色譜-質譜聯(lián)用法(HPLC-MS)[7]、毛細管電泳-二極管陣列檢測法(PCE-DAD)[8]等，這些方法雖具有很好的選擇性，但存在分析速度慢、操作較繁瑣、分析成本高、需使用有毒溶劑等缺陷。

近紅外(NIR)光譜是介于可見光與中紅外光的一種電磁輻射光譜[9-10]，由其發(fā)展的NIR分析技術由于速度快、無損、在線分析等突出優(yōu)點，在醫(yī)藥、食品、化工、農(nóng)業(yè)等方面具有廣泛應用[11-14]。但近紅外光譜分析的靈敏度較低，適用于含量大于0.1%的成分分析，對于微量成分，多利用吸附材料富集后再結合近紅外光譜分析技術實現(xiàn)檢測[15-16]。

離子液體(Ionic liquid,IL)是一種毒性很小的綠色溶劑，具有良好的導電性、溶解性、熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性，在化學工業(yè)、生命科學、環(huán)境等領域中有著廣泛應用[17-20]。Zeng等[21]研究發(fā)現(xiàn)，1-丁基-3-甲基咪唑溴化銨([Bmim]Br)水溶液可提高槐花中蘆丁的提取含量；Han等[22]用1-丁基-3-甲基硫酸鹽([Bmim][MS])水溶液結合超聲輔助萃取法，提取了芹菜中的木犀草素和芹菜素，提取率比傳統(tǒng)方法明顯增加；Guan等[23]也用相同的方法富集了五味子中的木酚素。

競爭性自適應權重(CARS)法是一種比較新穎的變量篩選方法，是模仿達爾文進化理論“適者生存”原則所建立的一種變量選擇方法，通過該方法可篩選出偏最小二乘回歸(PLS)模型中回歸系數(shù)絕對值大的波長點，篩除小的波長點，實現(xiàn)最優(yōu)波長變量的組合[24-25]。通過去除冗雜的信息，達到提高分析精度的目的[26]。本文合成了一種咪唑型離子液體吸附劑，快速方便地富集稀溶液中的木犀草素，采用CARS變量篩選結合連續(xù)小波變換(CWT)光譜預處理的近紅外光譜方法對木犀草素進行定量分析，為木犀草素提供了一種方便高效的檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

AntarisⅡ近紅外光譜儀、IR-200型紅外光譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；TU-1900型雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；JJ-2增力電動攪拌器(金壇市醫(yī)療儀器廠)；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；SF-TDL-250A低速離心機(上海菲恰爾分析儀器有限公司)；ME204E電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；DF-4型壓片機(天津市港東科技發(fā)展有限公司)；WS70-1紅外快速干燥箱(鄭州長城科工貿有限公司)。

木犀草素(色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；(3-巰基丙基)三甲氧基硅烷、1-烯丙基-3-甲基氯化咪唑、氨水、D-葡萄糖、氯化鈉(均為分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；偶氮二異丁腈(AIBN，分析純，上海試四赫維化工有限公司)；甲醇(色譜純，天津光復科技發(fā)展有限公司)；正硅酸乙酯(分析純，西安化學試劑廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 咪唑型離子液體吸附劑的合成參照Qiu等[27]的操作方法并適當改進：在三頸瓶中加入100 mL甲醇、2 mL(3-巰基丙基)三甲氧基硅烷和15 mL正硅酸乙酯，于室溫下攪拌30 min。然后加入2 mL純水和2 mL氨水攪拌24 h，停止攪拌后將產(chǎn)物用離心機離心，用純水洗滌至中性，再用甲醇洗滌2次，將所得樣品放置于培養(yǎng)皿中，常溫下晾干。即得巰基二氧化硅樣品，研磨備用。

將上述合成的巰基二氧化硅加入三頸瓶中，再加入100 mL甲醇和1 mL 1-烯丙基-3-甲基氯化咪唑，攪拌并水浴加熱至60 ℃，加入0.04 g AIBN，恒溫水浴攪拌48 h，離心，依次用純水、甲醇洗滌后常溫晾干，研細收集得到咪唑型離子液體吸附劑。其合成機理如圖1所示。

圖1 咪唑型離子液體吸附劑的合成機理Fig.1 Synthesis mechanism of imidazole ionic liquid adsorbent

1.2.2 木犀草素吸附實驗稱取0.15 g咪唑型離子液體吸附劑置于100 mL錐形瓶，加入一定濃度的木犀草素溶液，室溫下振蕩20 min。取樣，用量筒式過濾器過濾，濾液在347 nm波長下測量吸光度，并計算吸附率(F%)。吸附率按下式計算：F%=100%×(A0-A)/A0，式中，A0和A分別為木犀草素溶液吸附前、后的吸光度。

1.2.3 木犀草素樣品的制備與富集配制質量濃度為150 mg/L的木犀草素儲備液，于0～4 ℃儲存?zhèn)溆?。在制備木犀草素測試溶液時，加入一定量的氯化鈉、D-葡萄糖，以考察背景干擾對木犀草素測定的影響。將150 mg/L木犀草素儲備液適當稀釋，再加入1 mg/L氯化鈉、10 mg/LD-葡萄糖，配制質量濃度為0.3～15 mg/L的70個木犀草素測試溶液。稱取0.15 g吸附劑置于100 mL錐形瓶中，將70個木犀草素測試溶液加至錐形瓶中，常溫振蕩20 min后抽濾，收集濾渣，室溫晾干后得到70個木犀草素樣品，其中53個樣品為校正模型，17個樣品(4對重復樣本)為預測模型，用于近紅外光譜分析。

圖2 70個木犀草素樣品的近紅外光譜Fig.2 Near-infrared spectra of the 70 luteolin samples

1.2.4 光譜測量方法將光譜儀在室溫下預熱1 h，選擇近紅外積分球漫反射測量70個樣本的近紅外光譜，掃描波數(shù)范圍為4 000～10 000 cm-1，儀器分辨率為4 cm-1，測量時每隔1 h儀器自行進行背景校正。每個樣品的近紅外光譜經(jīng)過64次掃描，重復3次，將3次測量結果取平均值作為樣品的最終光譜數(shù)值。圖2為70個樣品的光譜圖，因木犀草素的含量較少，70個樣品的光譜圖很難用肉眼區(qū)分。為提高近紅外光譜的靈敏度，結合化學計量學方法，采用PLS方法構建模型。并根據(jù)儀器軟件TQ analyst 9選擇最佳波數(shù)范圍為4 156.7～7 552.8 cm-1。

1.2.5 CARS 變量篩選CARS方法采用Matlab R2010b軟件實現(xiàn)，是比較新穎的用于變量篩選的方法。該方法根據(jù)達爾文進化論中“適者生存”準則，將每個變量看成一個單獨的個體，對變量進行逐步淘汰選擇，去除不必要的信息，以提取光譜中與分析鑒定有關的有效變量信息，優(yōu)化最優(yōu)的變量子集，從而具有很高的計算效率，提高了模型的預測能力[28]。

2 結果與討論

2.1 巰基二氧化硅、1-烯丙基-3-甲基氯化咪唑、咪唑型離子液體吸附劑的紅外光譜

分別對巰基二氧化硅、1-烯丙基-3-甲基氯化咪唑和咪唑型離子液體吸附劑進行紅外光譜測試，掃描光譜范圍為400～4 000 cm-1，結果如圖3a、b、c所示。相比于曲線a和b，曲線c中1 568 cm-1(很弱)處的吸收峰源于咪唑環(huán)骨架振動，1 460 cm-1處為甲基 C—H 的變形振動吸收峰，1 190 cm-1(很弱)處為咪唑環(huán)的伸縮振動。在曲線a中2 750 cm-1處為巰基的吸收峰，而反應后該峰消失，并在1 080 cm-1出現(xiàn)了C—S—C的振動吸收峰，曲線b中1 580 cm-1處為碳碳雙鍵的振動吸收峰，強度很強，在反應后此峰消失。上述結果說明,1-烯丙基-3-甲基氯化咪唑與巰基二氧化硅反應形成了咪唑型離子液體吸附劑。

圖3 巰基二氧化硅(a)、1-烯丙基-3-甲基氯化咪唑(b)和咪唑型離子液體吸附劑(c)的紅外光譜Fig.3 Infrared spectra of sulfhydryl silica(a),1-allyl-3-methyl imidazole chloride(b) and imidazole ionic liquid adsorbent(c)

圖4 木犀草素標準溶液吸附前(a)及吸附后(b)的紫外光譜Fig.4 UV spectra for luteolin before(a) and after(b) adsorption

2.2 吸附條件的優(yōu)化

2.2.1 吸附劑用量的影響吸附劑用量是影響吸附效果的關鍵因素之一，為研究吸附劑用量與吸附率的關系，分別準確稱取0.1、0.15、0.2、0.3 g的咪唑型離子液體吸附劑置于100 mL錐形瓶中，加入10 mg/L木犀草素水溶液，充分振蕩20 min，抽濾，取上清液在347 nm波長下測其吸光度，并計算吸附率。結果表明，吸附率隨著吸附劑用量的增加而增加，吸附劑用量為0.15 g時，得到的吸附率最大(為90.9%)，用量大于0.15 g后吸附率無明顯變化。因此，選擇最佳的吸附劑用量為0.15 g。

2.2.2 pH值的影響考察了不同pH值時木犀草素溶液的吸附效果，分別在6個100 mL錐形瓶中加入 0.15 g咪唑型離子液體吸附劑，再依次加入pH 值為 2、4、6、7、8、10的10 mg/L木犀草素水溶液。振蕩20 min，抽濾，取上清液在347 nm波長下測定吸光度，并計算吸附率。結果顯示，當pH<7時，吸附率隨pH 值的增加而增加；pH 7時吸附率最大，達到90.1%；pH>7時，吸附率隨pH 值的增加而急劇下降。因此，選擇在pH 7條件下進行木犀草素的吸附。

2.2.3 振蕩時間的影響在pH 7條件下，準確稱取0.15 g咪唑型離子液體吸附劑，加入10 mg/L木犀草素溶液，常溫下分別振蕩2、5、10、20、40、60 min，同法測定吸光度并計算吸附率。結果表明，吸附率在20 min之前隨著振蕩時間的增加而逐漸增加，振蕩時間為20 min時吸附率達到最大(為90.5%)，20 min之后幾乎不變化。因此，選擇最佳振蕩時間為20 min。

2.3 咪唑型離子液體吸附劑對木犀草素的吸附效果

為探究咪唑型離子液體吸附劑對木犀草素的吸附效果，用10 mg/L木犀草素水溶液進行吸附實驗。對吸附前后的木犀草素溶液進行紫外可見光譜檢測(圖4)，由圖可知木犀草素的特征吸收波長為347 nm，與10 mg/L木犀草素標準溶液的吸收光譜(曲線a)相比，經(jīng)吸附劑吸附后的吸收光譜(曲線b)在347 nm處幾乎完全吸收，吸附率達90.9%。結果表明，該吸附劑對木犀草素具有良好的吸附作用。

2.4 吸附等溫線

為研究該吸附劑的等溫吸附行為，稱取0.15 g咪唑型離子液體吸附劑，分別加入20、50、70、100、150、200、250、300 mg/L的木犀草素溶液，振蕩20 min，離心5 min，取上清液在347 nm波長下測量吸光度并計算吸附量，繪制吸附等溫線。通過下式計算吸附劑的吸附量：Qe=(C0-Ct)×V×10-3/m,式中：Qe為1 g吸附劑吸附的木犀草素質量，mg/g；C0為木犀草素的初始質量濃度，mg/L；Ct為吸附后木犀草素的質量濃度，mg/L；V為溶液總體積，mL；m為吸附劑質量，g。

Langmuir等溫吸附模型可應用于研究吸附現(xiàn)象，該模型用公式(1)描述[29-30]：

(1)

式中：Ct為吸附后木犀草素的質量濃度，mg/L；Q0為理論的最大吸附量，mg/g；KL為Langmuir模型常數(shù)。

圖5 木犀草素的吸附等溫線Fig.5 The adsorption isotherm of luteolin

繪制木犀草素吸附量(Qe)與初始質量濃度(C0)的關系曲線，得到吸附等溫線如圖5所示。由圖可知，隨著初始質量濃度的增加，吸附量迅速增加，當木犀草素的質量濃度大于150 mg/L時，吸附量增加趨緩。以Ct/Qe對Ct繪圖得到關系曲線(如圖5插圖)，線性方程為：y=0.128 3x+1.363 9(r2=0.997 2)。由此可知該吸附符合Langmuir等溫吸附模型，根據(jù)線性方程得到木犀草素的最大吸附量為7.1 mg/g。

2.5 木犀草素的近紅外光譜定量分析結果

2.5.1 定量校正模型的建立以PLS建立木犀草素的定量校正模型，將70個樣品的光譜經(jīng)過無處理、一階導數(shù)(1st)、Savitzky-Golay平滑(SG)、連續(xù)小波變換(CWT)、多元散射校正(MSC)、標準正態(tài)變換(SNV)、MSC+CWT、SNV+1st等進行光譜預處理[31-33]，再通過蒙特卡洛交叉驗證(MCCV)[34]法確定模型的因子數(shù)(Component number)，經(jīng)過CARS波長變量優(yōu)選獲得最優(yōu)波長變量集，獲得更佳的定量模型為偏最小二乘回歸-競爭性自適應權重(PLS-CARS)法，并與未經(jīng)CARS變量篩選的模型進行對照。PLS和PLS-CARS均由Matlab R2010b軟件實現(xiàn)。

由于近紅外光譜中既包含木犀草素的光譜信息，也包含其他雜質的信息，通過采用合適的光譜預處理方法提取特征信息后進行分析。表1顯示各種光譜預處理得到的木犀草素定量模型的預測能力，以交叉驗證均方根誤差(RMSECV)、相關系數(shù)R值和預測殘差值(RPD)作為評價模型的指標，RMSECV反映了預測濃度與實際濃度的偏離程度，R值反映了預測濃度與真實濃度的相關關系，RPD反映了定量結果的好壞，一般RPD>2.5且值越大說明定量結果越好[35]。

由表1可知，相比于未經(jīng)處理的PLS方法，樣品經(jīng)1st、CWT、SNV+CWT、MSC、MSC+1st、MSC+CWT、SG、SNV和SNV+1st處理后，RPD值增加，說明光譜預處理可有效改善定量結果，但RPD值增幅偏小，定量效果不好。且RPD值均小于2.5，表明不能準確定量分析木犀草素。

表1 未經(jīng)CARS處理的木犀草素PLS模型的結果Table 1 Results of luteolin PLS model without CARS treatment

先采用CARS算法進行波長變量的優(yōu)選，對樣品進行1st、CWT、SNV、SNV+CWT、MSC、MSC+CWT、SG等光譜預處理后，再進行PLS分析，結果如表2所示。對比未采用CARS處理的模型，木犀草素樣品的變量數(shù)均為1 557個，主因子數(shù)最大為9(表1)；而采用CARS進行變量優(yōu)選后，所有近紅外光譜預處理分析木犀草素樣品的變量數(shù)均在60個以下，而且部分主因子數(shù)適當減小，除MSC+1st和SG兩種光譜預處理后的RPD下降外，其余光譜預處理方法的RPD值均有不同程度的提高。其中，MSC的RPD由2.02增至3.26，SNV由2.02增至3.24，CWT由2.18增至3.63，這3個預處理方法在CARS變量優(yōu)選后RPD增加明顯，其中CWT的RMSECV最小，R和RPD值最大，能夠達到定量分析的要求。結果表明，經(jīng)過CARS優(yōu)選有效的定量光譜信息后，CWT預處理光譜的定量效果最好。

表2 經(jīng)過CARS處理的木犀草素PLS 模型的結果Table 2 Results of luteolin PLS model with CARS treatment

2.5.2 定量模型的驗證為驗證木犀草素定量校正模型的預測能力，使用17個外部預測集樣品(4對重復樣品)檢驗所建的校正模型，預測集的實驗條件與校正集相同，并采用CWT光譜預處理進行驗證,建立了預測濃度與參考濃度之間的關系(圖6)。結果顯示，未經(jīng)CARS變量篩選前(圖6A),預測濃度和參考濃度之間擬合關系的相關系數(shù)(R)為0.939 8，預測均方根誤差(RMSEP)為1.173 3 mg/L，預測集樣本回收率為83.2%～127%。經(jīng)CARS變量篩選并用CWT光譜預處理后(圖6B)，兩者之間的擬合程度更好,R為0.950 3，RMSEP為1.100 8 mg/L，預測集樣本回收率為77.8%～116%。結果表明，經(jīng)CARS變量篩選處理并用CWT光譜預處理的模型定量效果更好，能夠更準確地進行木犀草素含量的測定。

3 結 論

本文制備了一種咪唑型離子液體吸附劑，考察了吸附劑用量、pH值、振蕩時間對稀溶液中木犀草素吸附效果的影響，結果表明在吸附劑用量為0.15 g、pH值為7、振蕩時間為20 min時，吸附率達到最大(為90.9%)；另外通過吸附等溫線得到該吸附劑對木犀草素的最大吸附量為7.1 mg/g。采用近紅外光譜CARS變量篩選的方法對木犀草素進行了定量校正模型研究。結果顯示，相比于未經(jīng)CARS變量篩選的模型，經(jīng)CARS變量篩選后所有近紅外光譜預處理的樣本變量數(shù)大大減少，由1 557個降為60個以下，部分主因子數(shù)適當減小，除MSC+1st和SG兩種光譜預處理后的RPD結果下降外，其他光譜預處理的RPD結果均有提高。其中采用CWT光譜處理方法進行模型驗證時，RPD由2.18提高到3.63且為最大值，R最大，且RMSEP最小。通過定量模型的對比，說明采用CARS變量篩選結合CWT光譜預處理方法的預測結果更加準確，可實現(xiàn)對稀溶液中木犀草素的快速檢測。