夏珍珍，鄭 丹，夏 虹，姚晶晶，王勝鵬，仇建飛

(1．湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(武漢)，湖北武漢 430064；2．湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所,湖北 武漢 430064；3．吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(長春)，吉林 長春 130033)

香菇(Lentinuseduodes,Shiitake)是藥食同源的食用菌品種，富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，如人體必需氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素、多糖、核苷酸等?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)香菇子實體和菌絲中含有大量生物活性物質(zhì)，具有防癌、抗癌、降低血壓血脂等醫(yī)藥保健價值[1]。我國是香菇的發(fā)源地，早在4 000年前就有食用記載。由于香菇的附加產(chǎn)值較普通農(nóng)作物高，近年來香菇種植更是成為山區(qū)產(chǎn)業(yè)扶貧的重要模式之一[2]。目前我國的香菇主產(chǎn)區(qū)可分為東南(福建、浙江)、華中(湖北、河南)、東北(遼寧、吉林)和西南(四川、重慶、云南)等。隨著香菇種植范圍的擴(kuò)大，其產(chǎn)量也隨之增加,2018年我國香菇產(chǎn)量達(dá)1 043.12萬噸，占我國食用菌總產(chǎn)量的16.4%，是名副其實的主要品種[3]。

現(xiàn)有香菇的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)有兩項，分別為國家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T 38581-2020 香菇》[4]和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《GH/T 1013-2015 香菇》[5]。標(biāo)準(zhǔn)中的質(zhì)量評價指標(biāo)主要包括感官要求(形態(tài)、色澤、氣味等)、理化指標(biāo)(水分、砷、鉛、汞、鎘等重金屬指標(biāo))。感官指標(biāo)的描述多為無法量化的文字描述，理化指標(biāo)則是重金屬含量的要求，屬于安全要求。標(biāo)準(zhǔn)對于香菇中的多糖類物質(zhì)、蛋白質(zhì)類物質(zhì)、小分子揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)這類品質(zhì)指標(biāo)暫無規(guī)定。但是這類有機(jī)物與香菇的口感和營養(yǎng)價值密切相關(guān)，從而影響著消費者的購買習(xí)慣。栽培香菇的生長環(huán)境如光照、氣溫、水源等差異會造成香菇中有機(jī)物的累積差異，因而香菇的品質(zhì)跟種植的產(chǎn)地環(huán)境有很大的相關(guān)性。我國香菇種植范圍廣，不同產(chǎn)地間的香菇品質(zhì)參數(shù)差異很大[6]。隨著飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)整，人們對食物的營養(yǎng)價值要求提高。香菇品質(zhì)的高低不僅影響其內(nèi)含的有機(jī)物組成和含量，且不同品質(zhì)香菇間的售價也存在較大差異。有些不法商家更是為了經(jīng)濟(jì)利益，混淆產(chǎn)地，以次充好。針對這一問題，建立快速、準(zhǔn)確的香菇產(chǎn)地鑒別方法成為分析工作者的一項重要任務(wù)，且對保障香菇品牌和消費者利益具有實際意義。

目前用于產(chǎn)地鑒別的分析技術(shù)包括光譜法、質(zhì)譜法、分子生物學(xué)等[7]方法，但對于香菇產(chǎn)地的研究報道較少，僅有朱哲燕和王升等[6,8]分別利用中紅外光譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法的香菇產(chǎn)地研究。由于中紅外光譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法自身的特點，如對樣品的制備周期長、提取方法復(fù)雜耗時、有機(jī)溶劑消耗量大、分析速度長等，制約了其在快速分類領(lǐng)域的應(yīng)用。近紅外光譜技術(shù)因具有快速、無損、測量方便、成本低等特點已經(jīng)在食品、醫(yī)藥、石油領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[9-10]。近年來，近紅外光譜也廣泛用于小麥、芝麻、茶葉等農(nóng)產(chǎn)品真實性溯源方向[11-13]。但由于近紅外光譜吸收帶寬，光譜重疊嚴(yán)重，因而必須結(jié)合化學(xué)計量學(xué)才能實現(xiàn)定性、定量分析。本文采集不同產(chǎn)地干香菇樣品的近紅外漫反射譜結(jié)合不同的光譜預(yù)處理方法和波長選擇方法，建立了香菇產(chǎn)地鑒別模型，可為香菇的質(zhì)量控制提供新的評價方法。

1 實驗部分

1.1 儀器設(shè)備

采用美國Antaris型傅里葉變換近紅外光譜儀(Fourier transform near infrared spectrometer，F(xiàn)T-NIR)，測量選用積分球漫反射光學(xué)儀器，光譜掃描區(qū)間4 000 ～ 10 000 cm-1，光譜分辨率2 cm-1，InGaAs檢測器。光譜數(shù)據(jù)處理采用Matlab R2017b(The Math Works，Natick，USA)軟件。

1.2 樣品來源及光譜的獲取

采集吉林、湖北、福建不同產(chǎn)地的栽培香菇干樣共計113個，香菇分別購于基地和市場。在低溫4 ℃冷庫中避光保存。其中吉林香菇樣品58個，湖北香菇31個，福建香菇24個，香菇產(chǎn)地信息列于表1。采用粉碎機(jī)將樣品粉碎，過100目篩供光譜測試用。將樣品倒入與儀器配套的旋轉(zhuǎn)杯中充分壓實后采集光譜，每條光譜掃描64次取平均作為最終光譜。

表1 香菇樣本數(shù)和產(chǎn)地分布情況Table 1 Sample numbers and origins of the shiitake samples in the research

1.3 光譜數(shù)據(jù)處理

由于香菇樣本顆粒不均、獲得的近紅外光譜信息復(fù)雜，且存在一些噪聲、基線漂移、背景干擾等問題，需對光譜進(jìn)行一定的預(yù)處理，以提高模型的效果。運用到的預(yù)處理方法有求一階導(dǎo)數(shù)(First order derivative，1st)、小波變換(Continuous wavelet transform，CWT)、多元散射校正(Multivariate scatter correction，MSC)、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換(Standard normal transformation，SNV)等[14-17]。

由于近紅外光譜的譜峰寬，特征吸收不明顯，存在大量冗余信息，因此需進(jìn)行必要的波長篩選，挑選出特征波長進(jìn)行建模。隨機(jī)測試(Randomization test，RT)是由邵學(xué)廣課題組提出的一種變量篩選方法，隨機(jī)檢驗通過建立大量隨機(jī)模型，利用隨機(jī)模型與真實模型的統(tǒng)計值之間是否具有統(tǒng)計性差異確定有效參數(shù)[18]，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于近紅外數(shù)據(jù)的有效波長選擇[19]，本文采用該方法進(jìn)行特征光譜信息的篩選。

1.4 模型校正方法

偏最小二乘判別分析(Partial least squares discriminant analysis，PLSDA)是一種廣泛應(yīng)用的分類方法[20]，分別建立了3種香菇產(chǎn)地的判別模型。通過優(yōu)化最佳因子數(shù)得到最優(yōu)的判別模型，并通過模型預(yù)測的正確率評價3個產(chǎn)地的模型分類效果，模型的訓(xùn)練集和預(yù)測集樣品信息如表2所示。

表2 訓(xùn)練集和預(yù)測集樣品信息Table 2 Varieties of calibration set and prediction set of samples

2 結(jié)果與討論

2.1 不同產(chǎn)地香菇的光譜及其預(yù)處理

不同產(chǎn)地香菇的近紅外原始譜如圖1A所示，各近紅外光譜的變化趨于一致，分別在8 400、6 786、5 764、5 159、4 709、4 281 cm-1附近有較寬的吸收峰，主要為香菇中有機(jī)物的C—H、N—H、O—H振動的倍頻峰。在7 000 cm-1后香菇樣品的光譜出現(xiàn)漂移，因而需對上述光譜進(jìn)行一定的前處理。選取的光譜預(yù)處理方法包括CWT、1st、MSC和SNV，處理后的光譜如圖1(B～E)?？捎^察到，經(jīng)光譜預(yù)處理后可消除光譜間的漂移，增加光譜的分辨率。但由于不同產(chǎn)地香菇光譜間的差異較小，仍無法從譜圖信息上直接區(qū)分，需進(jìn)一步借助化學(xué)計量學(xué)的方法解析不同產(chǎn)地間香菇的近紅外光譜差別。

2.2 不同產(chǎn)地香菇的主成分分析

主成分分析(Principal component analysis，PCA)是一種常用的聚類分析方法，通過將多變量的光譜空間轉(zhuǎn)換為新變量空間來減少信息的冗余，從而最大限度的保留和發(fā)掘原光譜數(shù)據(jù)的特征。對栽培香菇的原始光譜進(jìn)行主成分分析，得到的前兩個主成分得分圖如圖2A所示，其中藍(lán)色圓點表示吉林省的香菇樣品，紅色點表示湖北省的香菇樣品，黑色點表示福建省香菇，前兩個主成分的貢獻(xiàn)率達(dá)到98.3%，包含了絕大部分的樣品信息。分別觀察各色圓點，發(fā)現(xiàn)各色圓點均有一定的聚集，整體看三色圓點有較大范圍的重合，且在第一主成分(PC1)上的重疊較第二主成分(PC2)嚴(yán)重。兩兩考察，黑色點與紅色點、黑色點與藍(lán)色點的重疊部分較大，而紅色點與藍(lán)色點的重疊范圍相對較小，總體看原始光譜的PCA聚類效果不好，未能發(fā)現(xiàn)各省份香菇的區(qū)分特征。為了提高PCA的分類效果，采用不同的光譜預(yù)處理技術(shù)以減少光譜的背景漂移和分辨率差等問題。經(jīng)不同的光譜預(yù)處理后的PCA得分圖如圖2(B～E)所示。

圖2B和C為經(jīng)CWT和1st處理后的前兩個主成分得分圖，前兩個主成分方差貢獻(xiàn)率分別為91.9%和91.7%，相比原始光譜的貢獻(xiàn)率有所下降但仍代表了絕大部分的樣品信息。相比原始光譜的得分圖，經(jīng)過處理后各色散點間的相互覆蓋程度有一定減少，尤其是紅色點與藍(lán)色點的重疊范圍進(jìn)一步減少，因而經(jīng)CWT和1st處理后光譜的PCA區(qū)分效果相對原始光譜變好。圖2D和E為經(jīng)MSC和SNV處理后的前兩個主成分得分圖，前兩個主成分方差貢獻(xiàn)率分別為76.5%和77.6%，與原始光譜和經(jīng)CWT和1st處理后光譜相比，經(jīng)MSC和SNV處理后其方差貢獻(xiàn)率進(jìn)一步下降，但依然解釋了大部分的樣品信息。且經(jīng)MSC和SNV處理的黑色和紅色圓點的聚集較原始光譜和CWT和1st處理的緊湊；藍(lán)色圓點的聚集程度也較原始光譜緊湊，但相比于CWT和1st的處理有所分散。觀察藍(lán)色點和紅色點的覆蓋程度(覆蓋程度越大表示各省類別相差越小，反之則越大)，表明其覆蓋程度相對于原始光譜有明顯減小，但相較于CWT和1st處理，從其對角線的角度觀察，兩色圓點覆蓋程度略有減小。綜上可知，經(jīng)過預(yù)處理的光譜PCA分類效果較原始光譜有較大改善，因而可以確定對原始光譜進(jìn)行預(yù)處理的必要，但不同預(yù)處理方法的改善效果差別不明顯。由于基于PCA只能定性的分析香菇產(chǎn)地，無法實現(xiàn)對未知香菇產(chǎn)地的鑒別，因而需對樣品進(jìn)一步建立各省份香菇的產(chǎn)地判別模型。

2.3 全譜段的香菇產(chǎn)地判別模型

通過PLSDA方法將每類產(chǎn)地的香菇樣品按照3∶1比例隨機(jī)分為建模集和預(yù)測集兩部分，建模集用于建立PLSDA判別模型，預(yù)測集用于考察已建立模型的判別效果，預(yù)測結(jié)果列于表3中，預(yù)測結(jié)果通過預(yù)測正確率表示，其中分省預(yù)測正確率和總預(yù)測正確率按照下列公式計算:

其中，與實際情況相符的樣本數(shù)量包括兩部分：樣本實際是屬于該省份且模型預(yù)測為“是”的情況和樣本實際不屬于該省份且模型預(yù)測為“不是”的情況。

以表3中Raw+PLSDA結(jié)果為例，吉林省的預(yù)測集樣本共有33個，其中屬于吉林省的樣本為17個，預(yù)測屬于吉林省樣品17個，不屬于吉林省樣本16個，預(yù)測不屬于吉林省樣本13個，因此與實際情況相符的樣本數(shù)量為30個，則吉林省的分省預(yù)測正確率為90.91%。同理，湖北省和福建省的分省預(yù)測正確率分別為93.94%和96.97%，最終的總預(yù)測正確率為93.94%。

從表3還可以看出，通過CWT、1st、MSC、SNV預(yù)處理后光譜的PLSDA的分省預(yù)測正確率較原始光譜的分省預(yù)測正確率有所變化，如吉林省的預(yù)測正確率得到提高。分析湖北省PLSDA的預(yù)測率，CWT處理后預(yù)測正確率略有提升，1st和MSC處理后的模型正確率維持不變，SNV處理后的模型正確率略有降低。分析福建省PLSDA的預(yù)測率，除MSC方法處理后預(yù)測率較原始數(shù)據(jù)持平，其他處理方法的預(yù)測率均略有下降，但也均為93.94%。比較3個省的總預(yù)測正確率，發(fā)現(xiàn)CWT處理較原始光譜和其他處理方式的光譜的模型預(yù)測正確率高，達(dá)到95.96%。因而選擇CWT預(yù)處理方法對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)處理。

表3 不同預(yù)處理的PLSDA的分類結(jié)果Table 3 The results predicted of PLSDA by different preprocessing method

2.4 選擇波長的香菇產(chǎn)地判別模型

全波長范圍的近紅外光譜存在大量冗余信息，采用全波長進(jìn)行分類建模，會增加計算量。為了選擇有效的變量需要進(jìn)行波長選擇，選擇RT方法來進(jìn)行模型優(yōu)化。選擇波長后的模型預(yù)測結(jié)果見表4。將Raw+RT+PLSDA的預(yù)測結(jié)果與表3中Raw+PLSDA結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)選擇波長后，吉林、湖北、福建的預(yù)測正確率較原始光譜有所提高，總預(yù)測正確率由93.94%提高到95.96%。其中福建省的預(yù)測正確率提高最明顯，達(dá)到100%；吉林省的模型預(yù)測正確率提到93.94%；而湖北省的模型預(yù)測正確率維持不變，推測可能是由于此處建模樣品數(shù)量較少造成，但通過減少參與建模的波長，客觀上降低了模型的冗余度，提高了模型的解釋性，因而選擇波長是必要的。

經(jīng)CWT預(yù)處理和RT選擇特征波長后，PLSDA的總預(yù)測正確率也有所提高，達(dá)到96.97%。其中，吉林省的模型預(yù)測正確率提高最明顯，達(dá)到100%，湖北省的模型預(yù)測正確率達(dá)96.97%，福建省的模型預(yù)測正確率下降至93.94%，但CWT+RT+PLSDA模型預(yù)測的總預(yù)測正確率還是較Raw+RT+PLSDA模型的預(yù)測正確率提高了近1%。因而得出，CWT結(jié)合RT得到的香菇產(chǎn)地模型預(yù)測效果優(yōu)于原始光譜結(jié)合RT，對原始光譜進(jìn)行預(yù)處理十分必要。另外，通過RT波長選擇后，原始光譜的3 112個變量，縮減到1 200個變量以下，極大地降低了運算的數(shù)據(jù)量，其選擇的具體波長分布見圖3。

表4 波長選擇后的PLSDA的分類結(jié)果Table 4 The results predicted of PLSDA by different wavelength selection methods

3 結(jié) 論

本文研究了利用近紅外光譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法快速區(qū)分香菇地理起源的可行性，為香菇產(chǎn)地的快速無損判別提供了一種新方法。對于地理特征，采用PLSDA分別建立了吉林、湖北、福建等香菇主產(chǎn)省份的產(chǎn)地判別模型，然后通過4種光譜預(yù)處理方法和波長選擇方法進(jìn)行優(yōu)化。判別分析模型效果均由預(yù)測集中的樣本預(yù)測正確率進(jìn)行評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CWT和RT的組合具有更好的預(yù)測結(jié)果。本方法為香菇產(chǎn)地的真實性溯源提供了一種新方法，在香菇產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有一定的實際意義，但由于文中建立的香菇產(chǎn)地判別模型僅覆蓋吉林、湖北、福建3個香菇主產(chǎn)省份，并未覆蓋全國樣品，無法實現(xiàn)除此之外其他省份的香菇產(chǎn)地判別，后續(xù)將繼續(xù)擴(kuò)大樣品覆蓋范圍，從而擴(kuò)大香菇產(chǎn)地判別模型的應(yīng)用省份。