楊 越，楊留長(zhǎng)，紀(jì)曉亮，李易航，徐倩茹，佟海濱*

(1.溫州大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035;2.浙江省水環(huán)境與海洋生物資源保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325035；3.溫州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，浙江 溫州 325035)

提取是中藥生產(chǎn)的首要工藝，其中間體的質(zhì)量會(huì)直接影響后續(xù)生產(chǎn)過(guò)程的中間體及最終產(chǎn)品的質(zhì)量。目前，提取工藝的質(zhì)量控制主要采用抽樣和離線方式，依據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用常規(guī)分析方法(如紫外-可見分光光度法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法)檢測(cè)提取過(guò)程中間體。然而，這些方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，難以快速測(cè)定，無(wú)法實(shí)時(shí)監(jiān)控生產(chǎn)過(guò)程中藥效成分含量的變化情況，從而導(dǎo)致產(chǎn)品批次間的質(zhì)量差異較大。因此，亟需研究一種適用于中藥生產(chǎn)過(guò)程的快速分析方法，這將有助于實(shí)現(xiàn)中藥生產(chǎn)過(guò)程的實(shí)時(shí)檢測(cè)與優(yōu)化控制，對(duì)于推進(jìn)中藥產(chǎn)業(yè)智能制造和保證產(chǎn)品質(zhì)量具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

近紅外光譜(NIRS)技術(shù)是一種間接的分析方法，往往需要結(jié)合計(jì)量學(xué)模型進(jìn)行分析測(cè)定。其具有快速、無(wú)損、綠色，以及多組分同時(shí)測(cè)定等特點(diǎn)[1-4]，目前已被廣泛應(yīng)用于中藥藥效成分的含量測(cè)定[5-6]、天然產(chǎn)物的鑒別[7-9]和藥材的快速鑒定[10-12]等方面。此外，NIRS由于無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，特別適合在線分析，因而被越來(lái)越多地應(yīng)用于中藥生產(chǎn)過(guò)程的質(zhì)量控制[13]。

柴胡化學(xué)成分復(fù)雜，其中皂苷類、黃酮類、多糖類為其主要活性成分[14-15]，具有抗輻射、抗病毒、抗?jié)?、降血脂、增?qiáng)免疫力等療效[16-17]。本文將NIRS應(yīng)用于柴胡的提取過(guò)程研究，以總黃酮、多糖、柴胡皂苷A和柴胡皂苷D為質(zhì)量指標(biāo)，收集提取液樣品，采集所有樣品的近紅外光譜圖并采用傳統(tǒng)分析方法測(cè)定其指標(biāo)含量，結(jié)合偏最小二乘法(PLS)建立柴胡提取過(guò)程中各指標(biāo)的定量校正模型，對(duì)各指標(biāo)成分含量進(jìn)行快速分析，以實(shí)現(xiàn)中藥提取過(guò)程中的質(zhì)量快速監(jiān)測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

Agilent 1260高效液相色譜儀(Agilent Technologies，USA)；Waters Xbridge C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；Antaris Ⅱ傅里葉變換近紅外光譜儀(Thermo Fisher，USA)；TU1810紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；FA2004電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)；DK-S24電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；2 L三口圓底燒瓶。

聚醚砜超濾膜(直徑：47 mm，孔徑：0.22 μm，北京京啟華誠(chéng)科技發(fā)展有限公司)；乙腈(色譜純，Merck，Germany)；濃硫酸、甲醇、苯酚、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；蘆丁、葡萄糖、柴胡皂苷A、柴胡皂苷D對(duì)照品(純度均大于98%，成都曼思特生物科技有限公司)；超純水(Millipore，USA)；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水；自藥店購(gòu)買藏柴胡，經(jīng)溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院佟海濱副研究員鑒定。

1.2 提取液樣品的制備

稱取1 kg柴胡藥材，置于2 L三口圓底燒瓶中，加入10倍量的水，煎煮60 min。煎煮自0 min開始每隔4 min收集10 mL提取液，并補(bǔ)充10 mL水，直至60 min為止。每批次煎煮60 min之后，立即連續(xù)收集5個(gè)提取終點(diǎn)樣本。重復(fù)6次提取實(shí)驗(yàn)，共收集126個(gè)樣品。

1.3 近紅外光譜的采集

采集柴胡提取液樣品的透射光譜，設(shè)定光譜掃描范圍為4 000～10 000 cm-1，掃描次數(shù)為64次，分辨率為8 cm-1，液體樣品池為0.5 mm光程的石英比色皿，以空氣為參比，每份樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均光譜用于后續(xù)數(shù)據(jù)處理以減小誤差。

1.4 藥效成分含量的測(cè)定

1.4.1 總黃酮含量的測(cè)定

(1)對(duì)照品溶液的制備; 采用蘆丁作為對(duì)照品，利用紫外可見分光光度法測(cè)定柴胡中的總黃酮含量[18-20]。精密稱定干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品10.12 mg，置于25 mL容量瓶中，加水適量，水浴微熱使之溶解，加水至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為404.8 μg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制; 精密量取蘆丁對(duì)照品溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分別置于25 mL量瓶中，各加水至6.0 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液l mL，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min。以相應(yīng)的試劑為空白對(duì)照，在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，蘆丁的質(zhì)量濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為Y=12.471X-0.000 04(0～48.576 μg/mL)，r2為0.999 7，說(shuō)明方法的線性關(guān)系良好。

(3)供試品溶液的制備; 取柴胡提取液于離心機(jī)中，3 800 r/min離心10 min后，取上清液3 mL于25 mL試管中，加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min后，加10%硝酸鋁溶液l mL，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min。以相應(yīng)的試劑為空白對(duì)照，在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.4.2 多糖含量的測(cè)定

(1)對(duì)照品溶液的制備; 采用無(wú)水葡萄糖作為對(duì)照品，利用紫外可見分光光度法測(cè)定柴胡中的多糖含量[20-22]。精確稱定干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品4.00 mg，置于50 mL容量瓶中，加水適量，水浴微熱使之溶解，加水至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.080 mg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液。

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制; 精密量取葡萄糖對(duì)照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于試管中，每管加入水使溶液總量達(dá)到1 mL。再分別加入6%苯酚0.5 mL和濃硫酸2.5 mL，振蕩均勻，放置30 min。以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，葡萄糖的質(zhì)量濃度(X，mg/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為Y=60.557X+0.000 8(0～0.020 mg/mL)，r2為0.999 8，說(shuō)明方法的線性關(guān)系良好。

(3)供試品溶液的制備;取柴胡提取液于離心機(jī)中，3 800 r/min離心10 min后，取上清液1 mL，置于250 mL容量瓶中定容至刻度，搖勻，精密量取1 mL，再分別加入6%苯酚0.5 mL和濃硫酸2.5 mL，振蕩均勻，放置30 min。以相應(yīng)的試劑為空白對(duì)照，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.4.3 柴胡皂苷A與柴胡皂苷D含量的測(cè)定

(1)對(duì)照品溶液的制備;取柴胡皂苷A、柴胡皂苷D對(duì)照品各適量，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容得柴胡皂苷A、柴胡皂苷D標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取柴胡皂苷A、D標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為58、59 μg/mL的柴胡皂苷A與柴胡皂苷D混合對(duì)照品溶液。

(2)供試品溶液制備; 取柴胡提取液，用聚醚砜超濾膜過(guò)濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

(3)HPLC條件;色譜柱：Waters Xbridge C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相：水-乙腈；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；柴胡皂苷A梯度洗脫：0～20 min：45%～50%乙腈；柴胡皂苷D梯度洗脫：0～20 min：50%～58%乙腈。

(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制;取柴胡皂苷A與柴胡皂苷D混合對(duì)照品溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣1、2、3、4、5、6 μL，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，柴胡皂苷A的質(zhì)量濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。柴胡皂苷A的回歸方程為Y=20.689X-0.862(5.8～34.8 μg/mL)，r2為0.999 6，說(shuō)明方法線性關(guān)系良好。同樣取混合對(duì)照品溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣0.8、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 μL，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，柴胡皂苷D的質(zhì)量濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。柴胡皂苷D的回歸方程為Y=19.326X+5.214 5(4.72～11.8 μg/mL)，r2為0.999 2，說(shuō)明方法線性關(guān)系良好。

1.4.4 方法學(xué)考察

(1)精密度試驗(yàn); 取一批樣品溶液，在上述方法條件下連續(xù)測(cè)定6次，以總黃酮、多糖、柴胡皂苷A及柴胡皂苷D的吸光度或峰面積進(jìn)行精密度考察。結(jié)果顯示，各成分的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.201%、0.084 8%、0.049%、0.442%,表明該方法的精密度良好，符合定量要求。

(2)穩(wěn)定性試驗(yàn); 取同一樣品溶液適量，分別在0、1、2、4、8、12 h 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定4種成分的吸光度或峰面積，進(jìn)行穩(wěn)定性考察。結(jié)果顯示，各成分的RSD分別為0.683%、0.070%、0.210%、0.852%，表明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

(3)重復(fù)性試驗(yàn); 平行制備6份樣品溶液，在上述方法條件下測(cè)定，計(jì)算總黃酮、多糖、柴胡皂苷A及柴胡皂苷D含量，進(jìn)行重復(fù)性考察。結(jié)果顯示，各成分的RSD分別為0.429%、0.402%、0.952%、2.470%，表明方法的重復(fù)性良好，符合定量要求。

1.5 模型性能評(píng)價(jià)及數(shù)據(jù)處理

模型性能的評(píng)價(jià)通常采用校正集誤差均方根(Root mean square error of calibration,RMSEC)、預(yù)測(cè)集誤差均方根(Root mean square error of prediction,RMSEP)、校正集相關(guān)系數(shù)(Correlation coefficient of calibration,RC)、預(yù)測(cè)集相關(guān)系數(shù)(Correlation coefficient of prediction,RP)、預(yù)測(cè)集相對(duì)偏差(Relative standard of errors of prediction,RSEP)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察不同建模方法的優(yōu)劣[23-24]。通常R越接近于1，RMSEC和RMSEP之間的差距越小，則代表模型的預(yù)測(cè)性能越高。選擇合適的波段，在適宜的光譜預(yù)處理基礎(chǔ)上，運(yùn)用PLS建立NIRS與柴胡各指標(biāo)含量測(cè)定值之間的定量校正模型。各性能評(píng)價(jià)指標(biāo)的計(jì)算公式如下：

其中，Ci為參考方法測(cè)量值；i為NIRS模型預(yù)測(cè)值；Cn為校正集中Ci的平均值；Cm為預(yù)測(cè)集中Ci的平均值；n為校正集樣本數(shù)；m為預(yù)測(cè)集樣本數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)控指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

柴胡提取過(guò)程中的總黃酮、多糖、柴胡皂苷A和柴胡皂苷D的動(dòng)態(tài)變化曲線見圖1。從圖1中可以看出，提取液中4種藥效指標(biāo)的含量均隨時(shí)間呈上升趨勢(shì)。其中，總黃酮與多糖的含量在整個(gè)提取過(guò)程中持續(xù)上升；柴胡皂苷A含量呈現(xiàn)先快速增長(zhǎng)再緩慢增長(zhǎng)的趨勢(shì)；柴胡皂苷D含量在前10 min呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，之后趨于穩(wěn)定。

將第5批柴胡提取液樣品作為預(yù)測(cè)集，剩余5個(gè)批次的樣品作為校正集。各指標(biāo)成分的含量分布如表1所示?？梢钥吹剑Ｕ锌傸S酮、多糖、柴胡皂苷A和柴胡皂苷D的含量范圍分別為101.00～262.77 μg/mL、2.99～10.87 mg/mL、10.53～33.60 μg/mL、3.07～6.80 μg/mL；預(yù)測(cè)集中總黃酮、多糖、柴胡皂苷A和柴胡皂苷D的含量范圍分別為124.77～245.60 μg/mL、6.25～10.39 mg/mL、14.79～33.89 μg/mL、3.97～7.04 μg/mL。校正集指標(biāo)成分的含量范圍基本涵蓋了預(yù)測(cè)集，表明樣品分布合理，有利于建立高精度模型。

表1 校正集和預(yù)測(cè)集數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 1 Statistical results of samples in the calibration set and prediction sets

2.2 近紅外光譜的采集

近紅外光譜區(qū)域的主要光譜信息來(lái)源于含氫基團(tuán)如—OH、—NH和—CH 等的倍頻與合頻吸收，絕大多數(shù)生物化學(xué)樣品在此區(qū)域均有相應(yīng)的吸收帶，因此借助這些信息可進(jìn)行定性或定量分析。圖2為柴胡提取液樣本的原始近紅外光譜?？梢钥闯?，不同樣本的光譜特征并無(wú)顯著差異，在6 944 cm-1和5 155 cm-1附近有兩強(qiáng)吸收峰，分別為O—H基團(tuán)的一級(jí)倍頻和伸縮振動(dòng)組合頻區(qū)域。

圖2 柴胡提取液的原始近紅外光譜Fig.2 Raw near infrared spectra of samples collected from the extract of Bupleuri Radix

2.3 定量模型的建立與評(píng)價(jià)

2.3.1 異常光譜的剔除測(cè)量環(huán)境的改變，儀器和性能參數(shù)的變化等許多不確定性因素均會(huì)導(dǎo)致異常光譜的產(chǎn)生。異常光譜的存在會(huì)影響模型的準(zhǔn)確性和適用性，因此在建模之前，必須先排除異常光譜。本實(shí)驗(yàn)使用馬氏距離法識(shí)別異常光譜(馬氏距離是每個(gè)樣本光譜與所有樣本集平均光譜之間的距離，通過(guò)95%置信水平的Chauvenet檢驗(yàn)識(shí)別樣本是否異常[25])。如圖3所示，126個(gè)樣本中有8個(gè)樣本的馬氏距離超出閾值，屬于光譜異常樣本。異常樣本的總黃酮、多糖、柴胡皂苷A和柴胡皂苷D的含量均明顯低于其余樣本，4個(gè)指標(biāo)平均值分別為125.92 μg/mL、5.02 mg/mL、13.40 μg/mL、2.44 μg/mL，而其余118個(gè)樣本的4個(gè)指標(biāo)平均值則分別為210.12 μg/mL、7.89 mg/mL、26.23 μg/mL、5.12 μg/mL。刪除8個(gè)光譜異常樣本后，將剩余118個(gè)樣本用于后續(xù)模型的建立與驗(yàn)證。

圖3 異常光譜的判別Fig.3 Identification of outlier samples

表2 近紅外波段對(duì)PLS模型性能的影響Table 2 Effects of near infrared spectral section on PLS models

2.3.3 光譜預(yù)處理方法的選擇基線漂移、噪聲、環(huán)境、背景干擾等因素會(huì)對(duì)近紅外光譜產(chǎn)生明顯干擾[29-30]，為了提高信噪比和提升定量校正模型的準(zhǔn)確度和穩(wěn)健性[31]，在建模之前一般要對(duì)原始光譜進(jìn)行預(yù)處理。本實(shí)驗(yàn)基于上述最佳光譜波段，采用無(wú)光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理(No pretreatment)、一階導(dǎo)數(shù)(1D)、一階導(dǎo)數(shù)+SG平滑(1D+SG)、一階導(dǎo)數(shù)+Norris平滑(1D+Norris)、二階導(dǎo)數(shù)(2D)、二階導(dǎo)數(shù)+SG平滑(2D+SG)、二階導(dǎo)數(shù)+Norris平滑(2D+Norris)共7種不同光譜預(yù)處理方法對(duì)建模效果進(jìn)行考察，結(jié)果見表3。多糖和柴胡皂苷D模型在無(wú)預(yù)處理方式下RMSEC和RMSEP值最小且相近，RP值最大，模型性能最好；總黃酮和柴胡皂苷A模型分別在選用1D+SG和2D+Norris預(yù)處理時(shí)模型效果最好。為了提升模型預(yù)測(cè)精度，總黃酮、多糖、柴胡皂苷A和柴胡皂苷D分別選擇1D+SG、No pretreatment、2D+Norris和No pretreatment 4種光譜預(yù)處理方法。

2.3.4 主因子數(shù)的選擇在構(gòu)建PLS模型時(shí)，主因子個(gè)數(shù)的選擇會(huì)顯著影響模型的預(yù)測(cè)性能。主因子數(shù)過(guò)少則建模信息不全，出現(xiàn)“欠擬合”，導(dǎo)致模型精度不足；主因子數(shù)過(guò)多則會(huì)帶入大量無(wú)關(guān)信息(如噪音)，出現(xiàn)“過(guò)擬合”，導(dǎo)致模型預(yù)測(cè)能力明顯下降[32-33]。本研究以交叉驗(yàn)證誤差均方根(Root mean square error of cross validation,RMSECV)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察不同主因子數(shù)對(duì)PLS模型預(yù)測(cè)性能的影響。RMSECV值越小，代表模型預(yù)測(cè)性能越高，RMSECV最小值對(duì)應(yīng)的主因子數(shù)為最佳主因子數(shù)。結(jié)果表明，總黃酮、多糖、柴胡皂苷A和柴胡皂苷D的PLS模型分別選取主因子數(shù)為7、9、5、10時(shí)所得的RMSECV值最小。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇7、9、5、10分別作為總黃酮、多糖、柴胡皂苷A和柴胡皂苷D的最佳主因子數(shù)。

表3 不同光譜預(yù)處理方法對(duì)PLS模型性能的影響Table 3 Effects of different spectral pretreatments on models

2.3.5 近紅外定量模型的建立與驗(yàn)證基于上述優(yōu)化過(guò)程，建立了總黃酮、多糖、柴胡皂苷A和柴胡皂苷D的PLS定量校正模型。4個(gè)藥效指標(biāo)PLS模型的校正集和預(yù)測(cè)集中的參考值和近紅外預(yù)測(cè)值的相關(guān)性見圖4。從圖中可以看出，近紅外預(yù)測(cè)值與參考值表現(xiàn)出良好的擬合度，4個(gè)定量模型的RC和RP均大于0.9，RMSEC分別為4.18 μg/mL、0.358 mg/mL、1.61 μg/mL、0.401 μg/mL;RMSEP分別為3.46 μg/mL、0.743 mg/mL、1.53 μg/mL、0.406 μg/mL,每個(gè)模型的RMSEC和RMSEP較小且較為接近，并且總黃酮、多糖、柴胡皂苷A和柴胡皂苷D的RSEP分別為1.65%、8.28%、5.74%和7.52%，均在10%以內(nèi)。表明模型的預(yù)測(cè)精度較高，可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)柴胡提取液中總黃酮、多糖、柴胡皂苷A和柴胡皂苷D的含量。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證模型的預(yù)測(cè)能力，利用已校正的模型預(yù)測(cè)新的一批柴胡提取液樣品。結(jié)果如圖5所示，可看出模型給出的近紅外預(yù)測(cè)值與參考值十分接近，變化趨勢(shì)基本保持一致，表明采用NIRS可以成功預(yù)測(cè)柴胡提取過(guò)程中的4種藥效指標(biāo)。

3 結(jié) 論

本文采用NIRS結(jié)合PLS法建立定量校正模型，實(shí)現(xiàn)了柴胡提取液中總黃酮、多糖、柴胡皂苷A和柴胡皂苷D 4種成分的快速測(cè)定。所建定量模型的R值均在0.9以上，RSEP在10%以內(nèi)，模型的預(yù)測(cè)精度較高。該方法的操作簡(jiǎn)便、無(wú)需樣品預(yù)處理，且成本較低，不涉及有機(jī)試劑，綠色無(wú)污染，彌補(bǔ)了常規(guī)分析方法的不足，可推廣應(yīng)用于中藥提取過(guò)程的在線分析，這對(duì)于節(jié)約資源、提升中藥質(zhì)量控制水平具有重要的借鑒意義。