視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma, RB)是發(fā)生于兒童眼內(nèi)最常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，偶見(jiàn)成年人，對(duì)視力和生命威脅嚴(yán)重[1，2]。針對(duì)RB的治療，除了手術(shù)切除病灶，化療也非常重要。祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在治療各種腫瘤疾病中廣泛應(yīng)用，尤其是近年來(lái)開(kāi)發(fā)了不少中藥，這些藥物具有價(jià)格低廉、副作用少、容易獲取的優(yōu)勢(shì)，臨床治療方面正在逐步代替?zhèn)鹘y(tǒng)化療藥物。葫蘆素B(cucurbitacin B，CuB)是葫蘆素中含量最多的一種組分，具有抑制氧化反應(yīng)、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、降血脂、殺菌及消毒等藥理作用[3，4]。本研究擬通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討葫蘆素對(duì)RB細(xì)胞增殖及凋亡的影響。

資料與方法

一、材料

人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤系Y79(American Type Culture Collection，美國(guó)ATCC公司)，葫蘆素B(美國(guó)Sigma公司)，MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)，Hoechst 33342和碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)雙染試劑盒(南京建成生物研究所)，Annexin-V/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒，硝酸纖維素膜(上海碧云天公司)，Bax及Bcl-2抗體(上海聯(lián)邁生物工程有限公司)。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：RB細(xì)胞培養(yǎng)于含10 %胎牛血清的培養(yǎng)液(鏈霉素100 μg/ml、青霉素100 U/ml)內(nèi)，培養(yǎng)箱CO2體積分?jǐn)?shù)為5 %，溫度為37 ℃，每3 d更換一次新鮮培養(yǎng)液，細(xì)胞密度達(dá)到80%左右，胰酶消化后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.RB細(xì)胞分組：按照隨機(jī)數(shù)字法將RB細(xì)胞分為以下四組：對(duì)照組(細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng))；低濃度葫蘆素B(葫蘆素B濃度為1 μmol/l)組；中濃度葫蘆素B(葫蘆素B濃度為10 μmol/l)組；高濃度葫蘆素B(葫蘆素B濃度為100 μmol/l)，細(xì)胞生長(zhǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.RB細(xì)胞增殖率檢測(cè)：按照試劑盒說(shuō)明配置MTT溶液(用PBS配置，調(diào)整MTT液濃度為5 mg/ml，將PH值調(diào)至7.4)，胃癌SGC7901細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板內(nèi)，細(xì)胞密度為1×105/ml，PBS沖洗細(xì)胞后，加入配置好的MTT液培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加 150 μl DMSO液體，手動(dòng)搖晃混勻后測(cè)定570 nm吸光度值。

4.Hoechst 33342/PI雙染觀察細(xì)胞凋亡：收集細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度至5×105個(gè)/ml，加入10 μlHeochst33342染液，混勻后孵育10 min，PBS沖洗2次后加入5 μl PI染液，混勻后繼續(xù)室溫避光放置10 min，熒光顯微鏡下觀察，Heochst33342用波長(zhǎng)為352 nm的氪激光激發(fā)，PI用波長(zhǎng)為488 nm的氬離子激光激發(fā)。

5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：RB細(xì)胞接種于6孔板中，0.1%胰酶(不含EDTA)消化各組細(xì)胞后制備細(xì)胞懸液。800 r/min離心5 min后棄去上清收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至含有300 μl緩沖液的離心管中，重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/ml，分別加入5 μl Annexin-V和10 μl PI，室溫下避光反應(yīng)20 min后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

6.電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)改變：細(xì)胞經(jīng)3%戊二醛固定后以PBS沖洗3次，置于1%鋨酸固定液中2 h，PBS沖洗3次PBS沖洗3次后50%丙酮，70%丙酮，80%丙酮，90%丙酮依次梯度脫水，包埋后用檸檬酸鉛染色10 min，雙蒸水漂洗3～5次。待切片干燥后，透射電鏡觀察。

7.蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)RB細(xì)胞內(nèi)Bax及Bcl-2的蛋白表達(dá)：在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h后，在搖床上緩慢搖動(dòng)，分別用一抗、二抗孵育，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、葫蘆素B抑制RB細(xì)胞增殖

MTT結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞增殖率為96.33%，不同濃度葫蘆素B干預(yù)RB細(xì)胞48 h 后，其OD值均明顯降低(P<0.01，圖1)，RB細(xì)胞增殖率逐漸下降。

二、葫蘆素B促進(jìn)RB細(xì)胞凋亡及壞死

Hoechst33342染液能夠穿透正常細(xì)胞的細(xì)胞膜，染色后呈彌散的低藍(lán)光，對(duì)于凋亡細(xì)胞，Hoechst33342染液后呈亮藍(lán)色；PI不能穿透正常細(xì)胞的胞膜，但可以穿透壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜，熒光顯微鏡檢測(cè)時(shí)，被PI染液染色的細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光。我們的觀察結(jié)果顯示，伴隨葫蘆素B濃度增加，凋亡及壞死細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。

A示對(duì)照組 B示葫蘆素B低濃度組 C示葫蘆素B中濃度組 D示葫蘆素B高濃度組

三、葫蘆素B促進(jìn)RB細(xì)胞凋亡

為了進(jìn)一步檢測(cè)葫蘆素B促進(jìn)RB細(xì)胞凋亡率的影響，我們采用流式細(xì)胞技術(shù)方法測(cè)定了不同組別的細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)中使用的為Annexin V-FITC/PI雙染色檢測(cè)試劑盒。結(jié)果顯示，對(duì)照組RB細(xì)胞凋亡率為(2.57±1.43)%，隨著葫蘆素B作用濃度的遞增，RB細(xì)胞凋亡率也呈劑量依賴性遞增(17.97±3.45)%、(24.90±4.47)%、(35.40±5.43)%，圖3)。

四、電鏡觀察葫蘆素B對(duì)RB細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)照組RB細(xì)胞細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰易辨。葫蘆素B干預(yù)后RB細(xì)胞胞漿濃縮，細(xì)胞核染色質(zhì)凝結(jié)聚集在核膜周邊，呈新月?tīng)罨颦h(huán)狀小體改變，葫蘆素B高濃度組細(xì)胞漿腫脹明顯，可以觀察到空泡結(jié)構(gòu)，部分細(xì)胞細(xì)胞膜不完整，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變疏松并與胞膜融合形成空泡(圖4)。

五、葫蘆素B促進(jìn)線粒體凋亡信號(hào)通路

葫蘆素B低、中、高濃度干預(yù)RB細(xì)胞后，Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量分別下降至(65.44%±5.22)%、(86.67%±6.53)%和(107.18%±6.20)%，與對(duì)照組的蛋白相對(duì)表達(dá)量(52.25%±4.29)%比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)照組Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量為(112.10%±6.98)%，葫蘆素B低、中、高濃度干預(yù)后其相對(duì)表達(dá)量分別下降至(86.43±5.83)%、(49.08±3.57)%、(27.05±3.97)%，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5)。

討 論

RB具有家族遺傳傾向，是嬰幼兒眼病中危害性最大的一種惡性腫瘤，易發(fā)生顱內(nèi)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，常危及患兒生命[5，6]。

葫蘆素B是葫蘆素家族中含量最豐富的一種四環(huán)三萜類化合物，提取自葫蘆科等植物，具有天然、低毒、高效及價(jià)格低廉的特征[7，8]。既往已有多項(xiàng)研究證實(shí)葫蘆素B對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用。譚立君的研究結(jié)果顯示，葫蘆素通過(guò)阻滯卵巢癌細(xì)胞SKOV3的生長(zhǎng)周期，抑制轉(zhuǎn)錄激活因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)促進(jìn)SKOV3細(xì)胞凋亡[9]。在眼部，葫蘆素B通過(guò)誘導(dǎo)線粒體膜去極化、細(xì)胞內(nèi)ROS積累、改變相關(guān)蛋白表達(dá)、促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞凋亡[10]。本實(shí)驗(yàn)中MTT結(jié)果顯示，葫蘆素B濃度依賴性的抑制了RB細(xì)胞的生長(zhǎng)。

細(xì)胞凋亡多伴有形態(tài)上的改變。Hoechst 33342/PI染色法可以直觀的將細(xì)胞凋亡及壞死情況展現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組細(xì)胞均為暗藍(lán)色低熒光，葫蘆素B干預(yù)RB細(xì)胞后，亮藍(lán)色(凋亡細(xì)胞)及紅色(壞死細(xì)胞)細(xì)胞逐漸增多，證實(shí)葫蘆素B能夠誘導(dǎo)RB細(xì)胞凋亡。Annexin V-FITC/PI檢測(cè)方法靈敏，能特異檢出凋亡早期細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率我們發(fā)現(xiàn)，伴隨葫蘆素B濃度升高，RB細(xì)胞凋亡率遞增。

Bax及Bcl-2均屬于細(xì)胞內(nèi)線粒體凋亡信號(hào)通路中的信號(hào)分子[11，12]。Western blot結(jié)果顯示，葫蘆素B促進(jìn)凋亡信號(hào)分子Bax的表達(dá)，抑制RB細(xì)胞中抗信號(hào)分子Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)一步說(shuō)明葫蘆素B能夠有效抑制RB細(xì)胞凋亡。

綜上所述，葫蘆素B通過(guò)線粒體途徑抑制RB細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡?；诤J素B天然、低毒、高效及價(jià)格低廉的特征，有望為RB治療提供新的藥物選擇。