蔡 科

（華東交通大學(xué)體育與健康學(xué)院，江西 南昌 330013）

香菇（Lentinus edodes） 為傘菌目 （Agaricales）口蘑科（Tricholomatacete）香菇屬（Lentinus）真菌[1]。香菇的藥用功效在古代醫(yī)學(xué)書籍中早有記載，《本草綱目》認(rèn)為香菇“甘，平，五毒”；《日用本草》中提到香菇“益氣，不饑，治風(fēng)，破血”，對腸胃來說是“大益胃氣”[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為香菇具有抗癌、抗腫瘤、抗疲勞等功效，并且可以防止病毒入侵，提高機體免疫力，其主要藥用成份是香菇多糖。香菇多糖（lentinan，LNT） 是從香菇子實體中提取的多糖類物質(zhì)，是一種高分子葡聚糖，也是香菇的主要活性物質(zhì)，其主要成份是甘露糖、葡萄糖醛酸、木糖、半乳糖和鼠李糖等組成的大分子多糖，分子量在400 kD～600 kD之間[3]。香菇多糖的功效近年來逐漸被人們所認(rèn)可，成為了一些疾病的輔助治療試劑。

骨骼肌占人體重量的近一半，是主要的運動器官組織。人體在進行持續(xù)性或高強度運動時，很容易引起骨骼肌損傷，機械性外力是骨骼肌受傷的主要原因，如拉傷、碰撞等肌纖維受損；另外由于身體自身的代謝功能降低、炎癥等也會引起骨骼肌損傷[4]。骨骼肌在運動時的重要作用使其會經(jīng)常受到損傷，如運動員的各種運動型損傷會嚴(yán)重影響其競技水平和運動成績，即使是普通人的骨骼肌損傷也會對工作生活產(chǎn)生很大的影響。如何快速對骨骼肌損傷進行恢復(fù)成為了一個值得深入研究的問題。通過對香菇多糖在運動性骨骼肌損傷中的作用進行研究，對引起骨骼肌損傷的誘因進行分析，探討香菇多糖恢復(fù)骨骼肌損傷的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇干品由浙江方格藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，一等品，雜質(zhì)含量＜0.1%，清洗晾干后備用。

主要試劑有：丙酮、乙醚、無水乙醇（分析純），天津市紅巖化學(xué)試劑廠；異氟烷（含量99%），武漢潤澤偉業(yè)科技有限公司；水合氯醛（分析純），武漢博萊特化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TY-HX-0型電熱鼓風(fēng)熱循環(huán)烘箱，蘇州臺裕烘箱設(shè)備有限公司；BS210電子天平，塞多利斯天平有限公司；15型萬能粉碎機，江陰市振鋒藥化機械有限公司；SA101S型低氧跑臺運動系統(tǒng)，江蘇賽昂斯生物科技有限公司；9FZ-35型離心機，上海亞榮生化儀器廠；HF240-300全自動生化分析儀，山東濟寧正豐醫(yī)療科技有限公司；TM4000IIPlusII臺式掃描電鏡，日立高新技術(shù)集團。

1.3 香菇粗多糖提取

按照以下步驟進行香菇子實體多糖的提取。

取香菇干品，洗凈后在35℃的烘箱中烘干30 min，上粉碎機打成粉末過80目篩，按1∶10的料液比與80%乙醇混合進行，脫脂除去雜質(zhì)后過濾，再加水浸提2次，合并2次的提液體，在35℃的烘箱中低溫濃縮至溶液體積的60%后靜置24 h，

為了除去粗多糖中的水分，取提取液的沉淀物加入丙酮，混勻后進行離心分離；再取沉淀物加入乙醚，混勻后進行離心分離；取離心后的溶液后再加無水乙醇，混勻離心分享后將沉淀物放在通風(fēng)櫥中自然揮發(fā)干燥，即可得香菇粗多糖提取物。

1.4 試驗動物

試驗采用SD大鼠50只，雌雄各半，體重（220±10） g，購自濟南市金豐實驗動物有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（魯） 2014 0006。實驗室飼養(yǎng)條件：溫度為20℃～22℃，濕度在50%左右，24 h飼料投喂量約為10 g·100-1g-1（標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料），飲水量約為15 mL·100-1g-1，喂養(yǎng)期間，12 h/12 h燈光交替，保持安靜避免噪聲、騷擾。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，取40只大鼠隨機分成4組，每組10只，開始試驗。

1.5 骨骼肌損傷恢復(fù)試驗方法

1.5.1 跑臺適應(yīng)性訓(xùn)練

對適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后的大鼠進行跑臺適應(yīng)性訓(xùn)練，每次訓(xùn)練時間為20 min；跑臺適應(yīng)性訓(xùn)練期間跑臺可設(shè)置分段加速度以強化訓(xùn)練效果；跑臺訓(xùn)練期間每天經(jīng)口灌胃10 mg·kg-1的香菇粗多糖提取液，連續(xù)1周。

1.5.2 跑臺力竭訓(xùn)練建立大鼠骨骼肌損傷模型

末次訓(xùn)練后取訓(xùn)練合格的大鼠（能連續(xù)在跑臺上跑步20 min），禁食12 h后使用低氧跑臺運動系統(tǒng)進行力竭式跑臺訓(xùn)練。禁食的目的一方面是避免大鼠體重有差異影響試驗精度，另一方面也為避免后期麻醉時的食物反流。跑臺系統(tǒng)不加電刺激，電機速度設(shè)定在 15 m·min-1～20 m·min-1范圍，跑臺傾角-20°，進行連續(xù)3組力竭式跑臺訓(xùn)練，每組力竭訓(xùn)練間休息5 min。力竭標(biāo)準(zhǔn)為大鼠有伏地動作，在跑臺末端停留2 s以上，跑臺系統(tǒng)模擬的光刺激和聲刺激仍不能繼續(xù)跑動，至此建立大鼠的骨骼肌損傷模型。

1.5.3 血清生化指標(biāo)檢測

力竭式跑臺訓(xùn)練后立即將大鼠放入水桶中，密閉后注入約3%濃度的異氟烷先將大鼠短時麻醉，以方便后期的固定注射；將短時麻醉的大鼠側(cè)臥身體伸展，使用7%水合氯醛，腹腔注射0.5 mL·100-1g-1，約2 min～5 min后進入麻醉期。麻醉后采用連續(xù)尾靜脈采血的方法，采集大鼠血樣2 mL，靜置0.5 h后上離心機機3 500 r·min-1離心15 min分離血清，采用全自動生化分析儀進行血清生化指標(biāo)的檢測。

1.5.4 骨骼肌超微結(jié)構(gòu)觀測

采血后解剖大鼠取大腿肌肉制作骨骼肌標(biāo)本，制備肌肉組織電鏡掃描切片觀察大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)。

1.5.5 分組

跑臺即刻組：建立骨骼肌損傷模型后，立即進行大鼠血清生化指標(biāo)檢測，制備骨骼肌電鏡掃描切片。

跑臺1 d組：跑臺訓(xùn)練和骨骼肌損傷模型建立同跑臺即刻組，在末次訓(xùn)練1 d后再進行麻醉、采血和骨骼肌切片標(biāo)本制作。

跑臺3 d組：跑臺訓(xùn)練和骨骼肌損傷模型建立同跑臺即刻組，在末次訓(xùn)練3 d后再進行麻醉、采血和骨骼肌切片標(biāo)本制作。

空白對照組：跑臺適應(yīng)性訓(xùn)練時正常飼養(yǎng)，不注射香菇多糖提取液。其它試驗步驟同跑臺即刻組。

2 試驗結(jié)果

2.1 大鼠血清生化指標(biāo)檢測

大鼠血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果見表1、圖1。

表1 大鼠血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果Tab.1 Test results of serum biochemical indexes of rats

由表1可知，大鼠經(jīng)跑臺力竭訓(xùn)練后，與對照組相比，跑臺即刻組血清中的乳酸肌氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK） 活性均顯著下降（P＜0.01）；與跑臺即刻組相比，跑臺1 d組血清中的LDH、CK活性也都有明顯下降（P＜0.05）；跑臺3天組的血清中的LDH、CK活性也明顯低于跑臺1 d組和跑臺即刻組，也具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。由圖1可以看出，隨著大鼠血清生化指標(biāo)檢測時間的推后，各組血清中的LDH、CK活性變化趨勢均呈下降狀態(tài)。

2.2 大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)變化

大鼠骨骼肌電鏡掃描結(jié)果見圖2。

如圖2所示，對照組基本看不到肌肉肌節(jié)結(jié)構(gòu)、肌絲幾乎不可見，橫紋紊亂、邊緣圖像模糊不清；跑臺即刻組骨骼肌肉能夠可見肌絲排列，但肌纖維增粗，肌纖維間隙變小，而且有錯位和粗細(xì)不規(guī)則現(xiàn)象；跑臺1 d組骨骼肌超微結(jié)構(gòu)更加清晰，完整細(xì)胞數(shù)量也有所增加；跑臺3 d組骨骼肌絲邊緣更加銳利，細(xì)胞排列也更加整齊規(guī)則，肌細(xì)胞形態(tài)異常現(xiàn)象較少。在圖2中，a、b、c、d依次為對照組、跑臺即刻組、跑臺1 d組和跑臺3 d組大鼠的大腿骨骼肌超微結(jié)構(gòu)圖像。

3 試驗結(jié)果分析

大鼠血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果表明，在連續(xù)灌胃了1周的香菇粗多糖提取液后，當(dāng)大鼠出現(xiàn)骨骼肌損傷時，血清中的LDH、CK含量均出現(xiàn)了明顯的下降。對照組由于沒有灌胃香菇多糖，血液的3項指標(biāo)很高。乳酸脫氫酶和肌酸激酶主要存在于骨骼肌組織中。當(dāng)骨骼肌受到損傷后肌肉細(xì)胞膜破裂會導(dǎo)致血液中的乳酸脫氫酶和肌酸激酶明顯增高，且受損傷越大這兩種酶含量升高就越明顯。乳酸脫氫酶是參與無氧氧化反應(yīng)的一種酶，它反映的是骨骼肌的無氧運動能力。香菇多糖可以修復(fù)受損的肌肉細(xì)胞，是很好的細(xì)胞修復(fù)劑。當(dāng)大鼠的骨骼肌細(xì)胞受損時，細(xì)胞膜上的受體會脫落，而多糖的大分子鏈可以即時補充連接上受體，從而減少細(xì)胞受體損傷，使細(xì)胞生理功能正常，人體自愈能力增強，防止因細(xì)胞膜受體減少而產(chǎn)生病變細(xì)胞。同時，香菇多糖對細(xì)胞膜的及時修補也使得細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)不再流出到血液中。因此，血液中的乳酸脫氫酶、肌酸激酶等含量就會下降。

在血液生化試驗中，隨著時間的推移，灌胃了香菇粗多糖提取液的跑臺即刻組、跑臺1 d組和跑臺3 d組大鼠血清中的LDH、CK活性均呈現(xiàn)下降趨勢，這說明香菇多糖對骨骼肌細(xì)胞的修復(fù)作用具有一定的長效性，即使在停止灌胃多糖后，前期的香菇多糖仍然起到一定的作用。

對大鼠骨骼肌電鏡掃描結(jié)果顯示，各試驗組和對照組都由于骨骼肌損傷造成骨骼肌電鏡超微結(jié)構(gòu)圖中出現(xiàn)肌纖維不規(guī)則排列等問題。可以看到，對照組的肌肉電鏡掃描圖模糊，出現(xiàn)大量的線粒體，已經(jīng)沒有了肌原纖維周圍的肌漿網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，肌小節(jié)混亂無序而且斷裂現(xiàn)象明顯。而灌胃了香菇多糖的各跑臺組情況要好很多，隨著時間的推移，肌肉超微結(jié)構(gòu)逐漸變好，肌肉纖維熔斷現(xiàn)象減少、肌漿網(wǎng)狀邊緣變清晰，顯示出良好的修復(fù)效果。香菇多糖對肌肉細(xì)胞的修復(fù)還體現(xiàn)在對自由基的清除能力上，骨骼肌損傷一個顯著的特征就是劇烈運動后產(chǎn)生過量的自由基，自由基的突然增加會引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，改變生物膜的原有結(jié)構(gòu)造成肌肉細(xì)胞的水腫、細(xì)胞膜破裂等，因此在電鏡下會看到肌肉細(xì)胞的壞死和破損現(xiàn)象。而香菇多糖具有清除自由基的功效，使骨骼肌的超微結(jié)構(gòu)更加整齊規(guī)則，肌纖維相互間拉力增強也有效降低了骨骼肌損傷的風(fēng)險。

4 結(jié)論

運動性骨骼肌損傷從微觀上來講是肌細(xì)胞的受損引起的一系列反應(yīng)，從宏觀上來講骨骼肌受損是因為運動過量或機械外力的作用。通過研究了香菇多糖對骨骼肌損傷的修復(fù)作用，大鼠力竭模型的試驗結(jié)果顯示，香菇多糖對大鼠的血清生化指標(biāo)和骨骼肌超微結(jié)構(gòu)均有積極的影響，可以加快運動性骨骼肌損傷的恢復(fù)。研究結(jié)果為骨骼肌損傷機制的研究和相關(guān)治療方案的制定提供了理論參考。