李銀鳳，劉曉柱

（貴州理工學(xué)院，貴州 貴陽 550003）

活性氧（reactive oxygen species，ROS） 主要包括超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（·OH）以及單線態(tài)氧（1O2）等，其化學(xué)性質(zhì)比氧更為活潑[1-3]。幾乎所有物種暴露在含氧環(huán)境下，均能產(chǎn)生ROS[4-5]。ROS在細(xì)胞中發(fā)揮著雙重作用：一方面，過量的ROS，會造成DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)體等細(xì)胞組分的損傷，影響細(xì)胞正常生命活動的進(jìn)行；另一方面，適量的ROS在細(xì)胞受到生物脅迫或者非生物脅迫時，可發(fā)揮信號分子和防御調(diào)節(jié)作用[6-8]。真核細(xì)胞的ROS來源包括細(xì)胞線粒體、NADPH氧化酶、多種酶系以及非酶系統(tǒng)等[9-11]。

NADPH氧化酶是一個多亞基構(gòu)成的蛋白復(fù)合物，可催化胞外O2生成超氧陰離子，并以此為基礎(chǔ)產(chǎn)生ROS[12]。在真菌界已發(fā)現(xiàn)NoxA、NoxB、NoxC 3個NADPH氧化酶亞家族[13]。NoxA為NADPH氧化酶亞家族一員，受到研究者的廣泛關(guān)注。NoxA與NoxB具有相同的保守結(jié)構(gòu)域，但其N端的結(jié)構(gòu)終端短于NoxB。研究發(fā)現(xiàn)，NoxA產(chǎn)生的ROS在真菌發(fā)育的信號通路中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，干擾NoxA的表達(dá)，使ROS的合成受阻，影響真菌子實體的分化以及生長發(fā)育[14-16]。

食用菌不僅營養(yǎng)豐富，且味道鮮美，深受廣大消費(fèi)者喜愛，已成為餐桌上一道常見的佳肴。分析食用菌NoxA蛋白結(jié)構(gòu)特點，可為研究NADPH氧化酶在食用菌發(fā)育信號通路中的作用提供理論依據(jù)，也為其母種的培養(yǎng)提供理論指導(dǎo)。通過從GenBank中下載平菇 （Pleurotus ostreatus） NoxA（PoNoxA）和雙色蠟?zāi)ⅲ↙accaria bicolor）NoxA（LbNoxA）蛋白序列，利用生物信息學(xué)方法比較了2種食用菌間NoxA蛋白的結(jié)構(gòu)特征，以期為食用菌的分子遺傳育種提供理論參考。

1 試驗方法

1.1 NoxA蛋白序列分析

檢索NCBI網(wǎng)站GenBank中食用菌NoxA序列，并下載平菇NoxA基因（JN638888.1） 編碼區(qū)mRNA序列和蛋白質(zhì)序列（AEP43807.1），雙色蠟?zāi)oxA基因核苷酸序列（XM_001873736.1） 和蛋白質(zhì)序列（XP_001873771.1）。采用DNAMAN、Clustal W進(jìn)行NoxA蛋白序列的多重線性比對。

1.2 NoxA蛋白理化性質(zhì)分析

采用ProtParam tool在線工具（http://www.expasy.org/tools/protparam.html）、序列處理在線工具包（http://www.bio-soft.net/sms/index.html）分析NoxA蛋白分子量、等電點、氨基酸組成，分子式、半衰期、不穩(wěn)定系數(shù)等；ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）在線分析NoxA蛋白親疏水性質(zhì)；SignalP 4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在線分析NoxA的信號肽切割位點。

1.3 NoxA蛋白結(jié)構(gòu)特征分析

采用TMHMM Server v.2.0 World Wide Web Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析NoxA跨膜結(jié)構(gòu)域；采用SMART（http://smart.emblheidelberg.de/）、DSC Secondary Structure Prediction Method（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_dsc.html）、WISS-MODEL Repository （https://swissmodel.expasy.org/repository）、NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）等在線工具分析NoxA蛋白結(jié)構(gòu)特征。

1.4 NoxA基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

NCBI網(wǎng)站GenBank中下載相關(guān)物種NoxA基因序列，通過Clustal W和MEAG X軟件構(gòu)建NoxA系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 NoxA蛋白序列特征

平菇（PoNoxA）、雙色蠟?zāi)ⅲ↙bNoxA） 的NoxA蛋白序列比較結(jié)果見圖1。

由圖1可知，二者氨基酸序列比對一致性較高，達(dá)80%。PoNoxA氨基酸個數(shù)為560個，LbNoxA氨基酸個數(shù)為551個。PoNoxA在第327位～第341位較LbNoxA多15個氨基酸； LbNoxA在第430位～第437位較PoNoxA多7個氨基酸。PoNoxA與LbNoxA具有2個相同的FAD結(jié)合模體（FAD binding motif）、4個NADPH結(jié)合模體（NADPH binding motif）以及4個亞鐵紅素結(jié)合位點（heme binding） 中的保守組氨酸殘基。二者NoxA氨基酸組成分析結(jié)果見表1。

表1 NoxA氨基酸組成分析結(jié)果Tab.1 Analysis of amino acid composition of NoxA

由表1可知，進(jìn)一步序列分析，PoNoxA堿性氨基酸（K、R） 為58個，酸性氨基酸 （D、E） 45個，疏水氨基酸（A、I、L、F、W、V） 220個，極性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y） 132個，脂肪族氨基酸（I、L、V） 112個，芳香族氨基酸（F、W、Y） 86個；LbNoxA堿性氨基酸（K、R） 56個，酸性氨基酸（D、E） 43個，疏水氨基酸（A、I、L、F、W、V） 222個，極性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y） 128個，脂肪族氨基酸（I、L、V） 120個，芳香族氨基酸（F、W、Y） 79個。2種食用菌NoxA氨基酸的組成（各種氨基酸的種類與個數(shù)）較為相似。

2.2 NoxA蛋白理化性質(zhì)

ExPASy分析蛋白分子量與等電點結(jié)果表明，PoNoxA分子式為 C2955H4422N780O777S23，理論分子量為64.04 kDa，理論等電點為9.30，在哺乳動物細(xì)胞中半衰期為30 h，脂肪系數(shù)為80.14，不穩(wěn)定系數(shù)為34.43，為穩(wěn)定蛋白；LbNoxA分子式為C2908H4394N770O761S20，理論分子量為63.00 kDa，理論等電點為9.39，在哺乳動物細(xì)胞中半衰期為30 h，脂肪系數(shù)為87.66，不穩(wěn)定系數(shù)為37.06，為穩(wěn)定蛋白。2種NoxA蛋白分子量、等電點、脂肪系數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)等均較接近。蛋白親疏水特性分析結(jié)果見圖2。

由圖2可知，PoNoxA蛋白最大親水位點為第154位，氨基酸為異亮氨酸（I），分值為3.133；最小疏水位點均為第342位，氨基酸為賴氨酸（K），分值為-2.389，親水性的總平均值（grand average of hydropathicity，GRAVY） 為-0.060。LbNoxA蛋白最大親水位點為第153位，氨基酸為異亮氨酸（I），分值為3.178；最小疏水位點均為第392位，氨基酸為酪氨酸（Y），分值為-2.289，GRAVY為0.004。因此，2種NoxA蛋白最大親水位點較為相似，但最小親水位點不同。

另外，蛋白信號肽切割位點分析結(jié)果表明，在2種NoxA蛋白中均未發(fā)現(xiàn)信號肽切割位點存在。

2.3 NoxA蛋白結(jié)構(gòu)特征

SMART分析了NoxA蛋白結(jié)構(gòu)特征，預(yù)測結(jié)果見圖3。蛋白特征位點分析結(jié)果見表2。

表2 NoxA蛋白特征位點分析結(jié)果Tab.2 Analysis of NoxA structure characteristics

由圖3、表2可知，在PoNoxA蛋白N端存在5個跨膜結(jié)構(gòu)，2個低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)；而LbNoxA蛋白N端存在6個跨膜結(jié)構(gòu)，中間區(qū)域存在1個跨膜結(jié)構(gòu)，未預(yù)測到低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)存在。因此，2種食用菌NoxA蛋白N端存在5個保守的跨膜結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)，且存在位置基本一致，僅相差1個位點。

采用TMHMM在線工具進(jìn)一步分析NoxA跨膜結(jié)構(gòu)特征，NoxA蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測見圖4。

由圖4可知，TMHMM預(yù)測的結(jié)果與SMART預(yù)測的結(jié)果較為一致。PoNoxA蛋白N端存在5個跨膜結(jié)構(gòu)，LbNoxA蛋白N端存在6個跨膜結(jié)構(gòu)，中間區(qū)域存在1個跨膜結(jié)構(gòu)。

蛋白的結(jié)構(gòu)匹配其功能，因此在線分析了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征，NoxA蛋白二級結(jié)構(gòu)結(jié)果及分析見圖5。

由圖5二級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)顯示，2種食用菌NoxA蛋白二級結(jié)構(gòu)中均包含了無規(guī)則卷曲（random coil）、α–螺旋（alpha helix） 和鏈延伸 （extended strand）3種結(jié)構(gòu)，其分析結(jié)果見表3。

表3 NoxA蛋白二級結(jié)構(gòu)分析Tab.3 Analysis of NoxA secondary structures

如表3所示，在PoNoxA蛋白二級結(jié)構(gòu)中，無規(guī)則卷曲數(shù)量最多，為311個；同樣，LbNoxA中無規(guī)則卷曲數(shù)目也最多，為326個，比PoNoxA多15個，盡管LbNoxA總的氨基酸數(shù)比PoNoxA氨基酸數(shù)少9個，但LbNoxA中無規(guī)則卷曲比例比PoNoxA高3.63%，LbNoxA所包含的阿爾法螺旋和鏈延伸2種結(jié)構(gòu)比PoNoxA低3.63%。

swiss model在線系統(tǒng)預(yù)測了NoxA蛋白三級結(jié)構(gòu)特征見圖6。

如圖6所示，2種食用菌NoxA蛋白三級結(jié)構(gòu)中同樣都包含無規(guī)則卷曲、α–螺旋和鏈延伸結(jié)構(gòu)，與其二級結(jié)構(gòu)較為一致。2種食用菌NoxA蛋白三級結(jié)構(gòu)整體特征較為一致。

蛋白質(zhì)的磷酸化修飾對蛋白質(zhì)的功能，特別是在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的功能發(fā)揮中起著至關(guān)重要的作用。因此對2種食用菌NoxA蛋白質(zhì)磷酸化位點進(jìn)行了分析，分析結(jié)果見表4、圖7。

表4 NoxA蛋白磷酸化位點分析Tab.4 Analysis of NoxA phosphorylation sites

由圖7、表4可知，2種NoxA蛋白質(zhì)中均存在著大量的磷酸化位點，包括絲氨酸（serine）位點、蘇氨酸（threonine） 位點以及酪氨酸（tyrosine） 位點，具有潛在的磷酸激酶特性。但2種NoxA蛋白質(zhì)中絲氨酸、蘇氨酸以及酪氨酸修飾位點個數(shù)不同，存在位置也有差異。PoNoxA中絲氨酸、蘇氨酸以及酪氨酸修飾位點個數(shù)均高于LbNoxA中相應(yīng)的磷酸化修飾位點。

2.4 NoxA系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用MEAG X軟件構(gòu)建了2種食用菌NoxA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖8。

由圖8可知，PoNoxA與LbNoxA基因親緣關(guān)系最近，位于同一分支；PoNoxA和LbNoxA基因與灰葡萄孢霉（Botryotinia fuckeliana） 的NoxA基因親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

3 討論

在動物、植物、部分真菌等由多細(xì)胞構(gòu)成的物種中，NoxA是細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，同時還可催化產(chǎn)生ROS；ROS作為一種細(xì)胞內(nèi)信號分子，具有調(diào)節(jié)多種生命活動的功能[17]。因此，分析食用菌NoxA蛋白結(jié)構(gòu)特點，可為研究NADPH氧化酶在食用菌發(fā)育信號通路中的作用提供理論依據(jù)。通過GenBank搜索得到平菇和雙色蠟?zāi)?種食用菌NoxA的基因與蛋白序列，并采用生物信息學(xué)方法分析了其NoxA蛋白結(jié)構(gòu)特點。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種食用菌在一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)以及三級結(jié)構(gòu)上較為一致，但也存在一些差別，如一級結(jié)構(gòu)中氨基酸的個數(shù)和比例均有所差異，二級結(jié)構(gòu)中雖然都存在無規(guī)則卷曲、阿爾法螺旋、鏈折疊結(jié)構(gòu)，但所占比例各不同。此外，2種食用菌NoxA的蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點等方面也存在差異。因此，推測2種NoxA蛋白功能較為類似，但不完全相同。

此外，分析NoxA蛋白結(jié)構(gòu)特點，可進(jìn)一步操縱其表達(dá)，為食用菌母種的培養(yǎng)提供理論指導(dǎo)。已有研究表明，調(diào)節(jié)真菌NoxA基因的表達(dá)，會影響ROS的合成，同時導(dǎo)致細(xì)胞生命活動受到影響。如Lara-Ortíz等[18]通過沉默構(gòu)巢曲霉 （Aspergillus nidulans）NoxA基因，發(fā)現(xiàn)構(gòu)巢曲霉不能有效形成閉囊殼，但其菌絲體的生長和無性生殖未受影響；突變柄孢殼委陵菜（Podospora anserina） NoxA基因，則導(dǎo)致其產(chǎn)囊體轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒熳幽覛みM(jìn)程受阻，與野生型菌株相比，ROS產(chǎn)生量明顯降低[19]。通過分析2種食用菌NoxA蛋白的結(jié)構(gòu)特點，可進(jìn)一步通過基因工程的方法，應(yīng)用于平菇與雙色蠟?zāi)⒌挠N中。