齊 丹，賴文婷，肖玉秀

(海南熱帶海洋學(xué)院 a.生態(tài)環(huán)境學(xué)院;b.理學(xué)院，海南 三亞 572022)

0 引言

馬尾藻(Sargassum)在我國多產(chǎn)于東南沿海的溫水海域，資源豐富，營養(yǎng)價(jià)值高，食用歷史悠久[1].研究表明，海藻中提取的海藻多糖及其衍生物具有免疫調(diào)節(jié)、降血脂、抗腫瘤、抗病毒、抗炎等多種生物和生理活性[2-6].多糖溶于水，不溶于乙醇.水提醇沉法便是根據(jù)多糖在水和乙醇中溶解度不同的特性，將其分離提取的一種方法.與其他提取方法相比，該方法成本低、生產(chǎn)方便、簡(jiǎn)單安全、可用于大規(guī)模生產(chǎn).本研究利用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化馬尾藻多糖的提取工藝，并研究其抗氧化性，旨在為馬尾藻的進(jìn)一步開發(fā)提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 樣品預(yù)處理

采集海南省三亞市潮間帶新鮮的大洲馬尾藻(S.dazhouense)，洗凈泥沙和表面鹽離子，80 ℃干燥，粉碎過50目標(biāo)準(zhǔn)篩，保存于干燥器內(nèi)待用.

1.2 多糖提取

參考于淑池等提取海南苦丁茶多糖的方法[7]，提取馬尾藻多糖.稱取一定量的干燥馬尾藻粉加入純水，一定溫度下恒溫水浴一段時(shí)間，不斷攪拌，靜置冷卻后離心，取上清液.多次提取，合并上清液.將多次提取后的上清液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，濃縮后溶液冷卻至常溫，活性炭脫色后緩慢加入乙醇，不斷攪拌，析出多糖沉淀，再次離心，收集多糖.最后將多糖依次用無水甲醇、丙酮和乙醚洗滌，除去水分和雜質(zhì)，將洗滌后的多糖溶解于100 mL去離子水中，得到多糖溶液.

1.3多糖提取率測(cè)定

采用苯酚-硫酸法[8-9]測(cè)定馬尾藻多糖濃度，計(jì)算提取率.

1.4正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定實(shí)驗(yàn)因素和水平，采用正交表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，利用正交設(shè)計(jì)助手和SPSSAU軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，優(yōu)化馬尾藻多糖提取工藝.

1.5馬尾藻多糖體外抗氧化性測(cè)定

1.5.1 馬尾藻多糖的DPPH抗氧化活性

采用DPPH法[10]測(cè)定馬尾藻多糖DPPH抗氧化活性.配制DPPH無水乙醇溶液，取不同濃度的馬尾藻多糖溶液與DPPH無水乙醇溶液混勻，控溫避光反應(yīng)30 min，517 nm處測(cè)吸光值.

1.5.2馬尾藻多糖對(duì)羥基自由基的清除作用

采用Fenton法[11]測(cè)定馬尾藻多糖對(duì)羥基自由基的清除作用.在9 mmol·L-1FeSO4溶液中加入不同濃度的馬尾藻多糖溶液，混勻后加入H2O2溶液，靜置10 min，再加入9 mmol·L-1水楊酸溶液，搖勻靜置1 h后，測(cè)510 nm處吸光值.

1.5.3 馬尾藻多糖的還原力測(cè)定

采用三氯乙酸法[12]測(cè)定馬尾藻多糖的還原力.分別取不同濃度的馬尾藻多糖溶液，加入pH6.6磷酸鹽緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液，混勻，50 ℃下水浴加熱20 min，冷卻至室溫，再分別加入三氯乙酸和FeCl3溶液，10 min后測(cè)定其在700 nm處的吸光度.

1.6數(shù)據(jù)處理

使用OriginPro 9.1進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并制圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 不同提取時(shí)間對(duì)馬尾藻多糖提取率的影響

分別稱取5份10 g預(yù)處理后的馬尾藻粉，采用1∶40的固液比加入400 mL的蒸餾水中，于80 ℃條件下，分別水浴提取2，3，4，5，6 h，將冷卻后的溶液在2 500 r·min-1的轉(zhuǎn)速下離心30 min.提取2次，合并上清液，然后測(cè)定多糖提取率，結(jié)果見圖1.

圖1 不同提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

從圖1可知，提取時(shí)間為2～4 h時(shí)，多糖提取率隨提取時(shí)間的增加而大幅度提高，從7.78 g·kg-1迅速升高至14.71 g·kg-1；提取時(shí)間為4～6 h時(shí)，多糖的提取率變化不大，維持在14.7～14.9 g·kg-1之間；當(dāng)提取時(shí)間為5 h時(shí)，多糖提取率最大，且為14.84 g·kg-1.

因此，馬尾藻多糖最佳提取時(shí)間約為4 h，此時(shí)多糖幾乎完全溶于水溶液中，再增加水浴時(shí)間，對(duì)馬尾藻多糖的提取率無明顯提高，而且增加能耗.

2.1.2不同水浴溫度對(duì)馬尾藻多糖提取率的影響

分別稱取5份10 g經(jīng)預(yù)處理后的馬尾藻粉，按1∶40的固液比加入蒸餾水，分別在60，70，80，90，100 ℃下水浴提取4 h，將冷卻后的溶液在2 500 r·min-1的轉(zhuǎn)速下離心30 min.提取2次，合并上清液，然后測(cè)定多糖提取率.

圖2 不同提取溫度對(duì)多糖提取率的影響

從圖2可知，提取溫度為60～70 ℃時(shí)，馬尾藻多糖提取率增長速度較慢，約為12.5 g·kg-1；提取溫度為70～90 ℃時(shí)，馬尾藻多糖提取率顯著增加，從12.64 g·kg-1增加至15.65 g·kg-1；提取溫度為90～100 ℃時(shí)，馬尾藻多糖提取率不再升高反而輕微降低.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)提取溫度為90 ℃時(shí)，多糖提取率最大(15.65 g·kg-1),因此，最佳提取溫度為90 ℃.

2.1.3 不同固液比對(duì)馬尾藻多糖提取率的影響

分別稱取5份10 g經(jīng)預(yù)處理后的馬尾藻粉，分別按1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60的固液比加入蒸餾水，在80 ℃下水浴提取4 h，將冷卻后的溶液在2 500 r·min-1的轉(zhuǎn)速下離心30 min.提取2次，合并上清液，然后測(cè)定多糖提取率，結(jié)果見圖3.

圖3 不同固液比對(duì)多糖提取率的影響

從圖3可知，固液比在1∶20～1∶30時(shí)，馬尾藻多糖提取率增加緩慢，由10.44 g·kg-1增加到11.08 g·kg-1；固液比在1∶30～1∶50時(shí)，馬尾藻多糖提取率迅速增加，從11.08 g·kg-1增加至15.20 g·kg-1；固液比在1∶50～1∶60時(shí)，馬尾藻多糖提取率基本不變，由15.20 g·kg-1增加到15.31 g·kg-1.因此，最佳的提取固液比為1∶50.

2.1.4 不同提取次數(shù)對(duì)馬尾藻多糖提取率的影響

分別稱取5份10 g經(jīng)預(yù)處理后的馬尾藻粉，按1∶40固液比加入蒸餾水，在80 ℃下水浴提取4 h，將冷卻后的溶液在2 500 r·min-1的轉(zhuǎn)速下離心30 min，分別提取1，2，3次，合并上清液，然后測(cè)定多糖提取率，結(jié)果見圖4.

圖4 不同提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響

從圖4可知，馬尾藻多糖在提取1次時(shí)，提取率為10.61 g·kg-1，并不能完全提取馬尾藻多糖；提取次數(shù)為2時(shí)，馬尾藻多糖的提取率達(dá)13.45 g·kg-1；提取次數(shù)3次時(shí)，馬尾藻多糖的提取率為13.54 g·kg-1，只比提取2次的結(jié)果高0.09 g·kg-1.從節(jié)約提取時(shí)間、成本和能耗角度考慮，提取次數(shù)為2次時(shí)最佳.

2.2正交試驗(yàn)優(yōu)化馬尾藻多糖提取條件

以多糖提取率為指標(biāo)，以提取時(shí)間、提取溫度、固液比、提取次數(shù)為因素，根據(jù)單因素最優(yōu)點(diǎn)確定各因素的水平值(表1).選用L9(34)正交表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，用正交設(shè)計(jì)助手軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，研究馬尾藻多糖提取工藝優(yōu)化(實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2)，以確定最優(yōu)工藝.

表1 正交因素水平表

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2(續(xù))

從表2可知，提取馬尾藻多糖的主次影響因素為：提取溫度>提取時(shí)間>固液比>次數(shù).根據(jù)極差分析可以得出最佳提取工藝條件組合為A3B2C3D3，即提取時(shí)間5 h，溫度90 ℃，固液比1∶60，提取次數(shù)3.

通過正交設(shè)計(jì)軟件和SPSSAU v20.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算分析，采用對(duì)提取率影響較大的時(shí)間、溫度、固液比進(jìn)行多因素方差分析，結(jié)果見表3和表4.

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析表

表4 三因素方差分析結(jié)果

從表4可知：提取時(shí)間和提取溫度呈現(xiàn)出顯著性(P<0.05)，說明主效應(yīng)存在，會(huì)對(duì)提取率產(chǎn)生差異關(guān)系；固液比沒有呈現(xiàn)出顯著性(P>0.05) ，說明固液比并不會(huì)對(duì)提取率產(chǎn)生差異關(guān)系.

為了評(píng)價(jià)最佳工藝穩(wěn)定性，稱取馬尾藻樣品10 g進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn).多糖提取率分別為18.59%，18.43%和18.65%，平均值為18.56%，可見A3B2C3D3提取率較為穩(wěn)定.

2.3體外抗氧化性

2.3.1 DPPH法抗氧化活性

DPPH(1,1-二苯基-2-吡啶酰肼)是一種穩(wěn)定的有機(jī)物自由基，能接受氫自由基或電子，成為一種穩(wěn)定的抗磁分子，在517 nm處有一強(qiáng)吸收峰，其褪色程度與其所接受的電子數(shù)成定量關(guān)系，被廣泛應(yīng)用于自由基的測(cè)定[13].

圖5 馬尾藻多糖對(duì)DPPH自由基清除能力

從圖5可看出，馬尾藻多糖具有一定的DPPH自由基清除活性，隨著多糖濃度升高，清除率逐漸增強(qiáng).當(dāng)多糖濃度為2 g·L-1時(shí)，對(duì)DPPH自由基清除率可達(dá)22.988%.

2.3.2 羥基自由基的清除作用

Fenton反應(yīng)是二價(jià)鐵與過氧化氫反應(yīng)生成羥基自由基進(jìn)行的后續(xù)一系列反應(yīng)的統(tǒng)稱[14].Fenton反應(yīng)生成羥基自由基，而多糖可以抑制反應(yīng)的進(jìn)行并清除已產(chǎn)生的羥基自由基，其清除能力可通過520 nm處的吸光度反應(yīng)[15].

從圖6可看出，馬尾藻多糖對(duì)羥基自由基具有一定的清除能力，隨著多糖濃度升高，清除率增強(qiáng).當(dāng)多糖濃度為0.1～1.0 g·L-1時(shí)，對(duì)羥基自由基清除率迅速增加;當(dāng)多糖濃度為1.0～2.0 g·L-1時(shí)，對(duì)羥基自由基清除率增長減緩;當(dāng)多糖濃度均為2 g·L-1時(shí)，羥基自由基清除率可達(dá)27.596%.

圖6 馬尾藻多糖對(duì)羥基自由基清除能力

2.3.3 馬尾藻多糖的還原力

還原力是評(píng)價(jià)抗氧化性的指標(biāo)之一.具有還原能力的物質(zhì)作為電子供體，能夠還原脂質(zhì)過氧化過程中的中間氧化產(chǎn)物，因此物質(zhì)的還原能力可以看作其潛在的抗氧化性能的重要體現(xiàn)[16].還原力測(cè)定的方法是利用樣品的抗氧化能力，可以把赤血鹽[K3Fe(CN)6]還原成黃血鹽[K4Fe(CN)6]，再將黃血鹽與含鐵離子的溶液混合反應(yīng)，測(cè)定生成的普魯士藍(lán)在700 nm波長吸光值，以此來檢驗(yàn)其生成量的多少.而吸光值的大小是判斷樣品還原能力的依據(jù)，樣品還原力越強(qiáng)，吸光值越高.

圖7 馬尾藻多糖的還原力

從圖7可看出，馬尾藻多糖雖具有一定的還原能力，且隨著多糖濃度升高，還原力越強(qiáng).當(dāng)多糖濃度為2 g·L-1時(shí)，吸光度值可達(dá)0.497，但明顯不及維生素C的還原性強(qiáng).當(dāng)維生素C濃度為2 g·L-1時(shí)，吸光度值可達(dá)1.324，此時(shí)馬尾藻多糖的還原力約為維生素C的1/3.

3 結(jié)論

多糖作為馬尾藻中重要的活性成分之一，具有廣闊的應(yīng)用發(fā)展前景.本研究首先采用正交實(shí)驗(yàn)方法，確定馬尾藻多糖的最佳提取工藝條件為提取時(shí)間5 h，溫度90 ℃，固液比1∶60，提取次數(shù)3.然后，通過DPPH法、Fenton法和三氯乙酸法，分別測(cè)定馬尾藻多糖對(duì)DPPH自由基、羥基自由基的清除能力和還原力.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，馬尾藻多糖具有明顯的抗氧化性.