鄭保霄,鄭春靜,張 玉,婁正家,李 娟,薛良義*

(1.寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211；2.寧波市海洋與漁業(yè)研究院，浙江 寧波 315010)

0 引言

同工酶是指具有相同催化作用而分子結(jié)構(gòu)不同的酶，普遍存在于動植物中[1-2]。同一物種的不同個體或同一個體的不同組織都可能具有不同的同工酶分布。通過分析同工酶的表型而獲知其基因型是生化遺傳分析的手段之一，可用于遺傳多態(tài)性座位的研究[3]。目前已有對多種魚類同工酶從不同角度的研究報道，在組織特異性方面，金春華 等[4]檢測了多種同工酶在大彈涂魚(Boleophthalmuspectinirostris)肝臟中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)三梨醇脫氫酶(SDH)和葡萄糖6磷酸脫氫酶(G6PDH)僅在肝臟中表達(dá)；徐鋼春 等[5]分析了刀鱭(Coilianasus)不同組織的乳酸脫氫酶(LDH)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)眼睛是刀鱭LDH表達(dá)較為典型的組織；張濤 等[6]研究了雙須葉須魚(Ptychobarbusdipogon)5種組織中蘋果酸脫氫酶(MDH)和LDH同工酶的表達(dá)特征，結(jié)果表明2種酶具有組織特異性。在性別特異性方面，龐秋香 等[7]研究了泰山赤鱗魚(Varicorhinusmacrolepis)蘋果酸酶(MEP)的表型差異，發(fā)現(xiàn)不同性別同一組織和同一性別不同組織之間都存在明顯差異,但在同一性別相同組織的不同個體之間不存在差異。在環(huán)境影響方面，曹永長 等[8]利用電泳法分析了鯪魚的酯酶(EST)，發(fā)現(xiàn)EST酶帶在不同溫度下發(fā)生了變化，推測鯪魚體內(nèi)的脂肪代謝在溫度適應(yīng)過程中發(fā)生了變化；黃福勇 等[9]研究了鳧溪香魚(Plecoglossusaltivelis)的15個同工酶，發(fā)現(xiàn)過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)3種同工酶可以結(jié)合來評價生理生化、環(huán)境因子對香魚機(jī)體保護(hù)系統(tǒng)的影響；LENRTOVet al[10]分析了環(huán)境污染對超氧化物歧化酶(SOD)的影響，在來自環(huán)境嚴(yán)重污染地區(qū)的魚類肝臟中發(fā)現(xiàn)了新的SOD亞型；KUZU et al[11]研究了重金屬對魚鰓中的碳酸酐酶Ⅰ和Ⅱ(CAⅠ和CAⅡ)同工酶活性的影響，結(jié)果表明Cu2+，Ag+，Cd2+和Ni2+離子對其均有抑制作用。在種質(zhì)鑒定方面，萬正義 等[12]通過分析長江四大家魚肌肉組織的LDH同工酶來進(jìn)行種質(zhì)鑒定；陳瑋彤 等[13]通過檢測渤海灣天津沿岸花鱸(Lateolabraxmaculatus)肝臟和肌肉組織中的7種同工酶來分析其遺傳多樣性。

藍(lán)點(diǎn)馬鮫(Scomberomorusniphonius)，又名鲅魚，隸屬于鱸形目、鯖科、馬鮫屬，屬暖水性中上層魚類，是東海、渤海和黃海地區(qū)主要的經(jīng)濟(jì)魚類資源之一。象山港位于浙江省中北部沿海，港內(nèi)營養(yǎng)鹽含量較高，餌料生物繁富，是藍(lán)點(diǎn)馬鮫在東海的自然繁殖場[14]。近年來因過度捕撈導(dǎo)致象山港海域的馬鮫魚資源出現(xiàn)衰退，因此研究和保護(hù)藍(lán)點(diǎn)馬鮫種質(zhì)資源顯得尤為重要。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚的研究多集中于洄游路線分析[15]、重要功能基因[16-17]、微衛(wèi)星位點(diǎn)[18]以及線粒體基因組等方面[19]。同工酶是在蛋白質(zhì)水平上研究物種遺傳多樣性，具有穩(wěn)定的特征，目前仍然是我國進(jìn)行生物種質(zhì)鑒定的標(biāo)準(zhǔn)方法之一。本研究采用垂直聚丙烯酰胺凝膠電泳，對象山港水域藍(lán)點(diǎn)馬鮫9種組織中的8種同工酶進(jìn)行分析，為藍(lán)點(diǎn)馬鮫的遺傳多樣性和種質(zhì)鑒定提供參考，為該漁業(yè)資源的保護(hù)和開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

實(shí)驗(yàn)所用的藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚于2017年4月中旬取自浙江省寧波市象山港，為近海即時捕撈的性腺成熟的活魚，雌雄各3條，全長(623.5±55.5) mm?；铙w解剖，每尾魚取心臟、鰓、腸、肌肉、胃、肝、眼、性腺和腎臟9種組織，分別裝于已編號的2 mL凍存管中，迅速投入液氮保存，帶回實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存至分析。取待分析的樣品各0.1 g，加入4倍量(v/w)的Tris-HCl緩沖液(0.01 mol/L，pH=6.8左右)，冰上勻漿后離心(4 ℃，13 000 r/min，30 min)，取上清液用于電泳。

1.2 電泳、染色及成像

采用聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳(Gradient Polyacrylamide Gel Electrophoresis，GPGE)對8種同工酶進(jìn)行分析。凝膠制備方法參考文獻(xiàn)[20]，組織化學(xué)染色方法參照文獻(xiàn)[21]，染色液配制見表1。用上述配置的染色液分別染色，步驟如下：電泳完成后，將凝膠取出，放入染色液中，LDH、MDH、葡萄糖脫氫酶(GDH)、G6PDH、EST、SDH和MEP的顯色需要在37 ℃避光20～30 min；SOD的顯色需要曝光3～5 min，在37 ℃溫育至有灰白色條帶出現(xiàn)。染色后的凝膠放入7%冰乙酸中固定脫色。

表1 同工酶染色液配方Tab.1 The formulation of isoenzyme staining solution

脫色后將凝膠板進(jìn)行拍照，并根據(jù)電泳圖譜結(jié)合相對遷移率和表達(dá)活性程度繪制酶譜模式圖，模式圖中的條帶顏色深淺與電泳酶帶活性強(qiáng)弱相對應(yīng)。

1.3 電泳結(jié)果記錄

同工酶的縮寫、基因座位和等位基因的命名采用SHAKLEE et al[22]推薦的方法，以同工酶縮寫名稱的大寫代表酶蛋白。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)共檢測了乳酸脫氫酶(LDH)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、葡萄糖脫氫酶(GDH)、葡萄糖6磷酸脫氫酶(G6PDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、酯酶(EST)、山梨醇脫氫酶(SDH)、蘋果酸酶(MEP)等8種同工酶在各器官組織中的表達(dá)模式，檢測結(jié)果見表2。

表2 同工酶在藍(lán)點(diǎn)馬鮫9種組織中的表達(dá)Tab.2 The expression of isoenzymes in nine tissues of Scomberomorus niphonius

2.1 各組織中的酶譜特征

2.1.1 乳酸脫氫酶(LDH E .C.1.1.1.27)

在藍(lán)點(diǎn)馬鮫9種組織中共檢測到7種LDH酶帶(圖1a)。LDH1僅在肌肉組織中表達(dá)，其他組織中均不表達(dá)；LDH2在9種組織中都表達(dá)，在肌肉和肝臟中活性較弱；LDH3～LDH7只在眼睛中表達(dá)。

2.1.2 蘋果酸脫氫酶(MDH E .C.1.1.1.37)

在藍(lán)點(diǎn)馬鮫9種組織中共檢測到7種MDH酶帶(圖1b)。MDH1和MDH2僅分別在腸和性腺中表達(dá)；MDH3在心臟和肌肉中表達(dá)；MDH4在腸、胃、肝臟、眼和腎臟五個組織中表達(dá)，其在腸和眼睛中活性較弱；MDH5在除腸和眼睛外的其余7個組織中均有表達(dá)；MDH6在心臟、鰓、腸、肌肉和性腺中表達(dá)；MDH7在心臟、肌肉和性腺中表達(dá)，活性較弱。

2.1.3 葡萄糖脫氫酶(GDH E.C.1.4.1.2)

由圖1中a可知，2種醬油在40～70天內(nèi)總氮呈總體上升趨勢，且pH值為5.4的醬油中含有更高的總氮值。pH 5.4條件下發(fā)酵的醬油總氮值由40天時的1.44 g/dL逐漸升高，至發(fā)酵55天時達(dá)到約1.53 g/dL，此后總氮含量逐漸趨于穩(wěn)定。而pH 6.5條件下發(fā)酵的醬油總氮則由40天時的約1.4 g/dL逐漸升高至約1.5 g/dL，略低于pH 5.4條件下發(fā)酵的醬油。

在藍(lán)點(diǎn)馬鮫9種組織中共檢測到3種GDH酶帶(圖1c)。GDH1僅在眼中檢測到，活性較弱；GDH2和GDH3僅在肝臟中檢測到，其余組織中均未檢測到相關(guān)酶帶。

2.1.4 葡萄糖6磷酸脫氫酶(G6PDH E.C.1.1.1.49)

在藍(lán)點(diǎn)馬鮫9種組織中共檢測到3種G6PDH酶帶(圖1d)。G6PDH1在除鰓外的其他組織均有表達(dá)；G6PDH2在鰓、肝臟和性腺中表達(dá)，G6PDH3僅在腸和腎臟中表達(dá)。G6PDH1和G6PDH2均在肝臟中的活性最強(qiáng)。

2.1.5 超氧化物歧化酶(SOD E.C.1.15.1.1)

在藍(lán)點(diǎn)馬鮫9種組織中共檢測到1種SOD酶帶(圖1e)，在鰓、腸、肝臟、性腺和腎臟表達(dá)，在肝臟中活性最強(qiáng)。

2.1.6 酯酶(EST E .C.3.1.1.1)

在藍(lán)點(diǎn)馬鮫9種組織中共檢測到5種EST酶帶(圖1f)。EST1在除肌肉和眼睛外其余7種組織中均有表達(dá)，在鰓和腸中的活性較弱；EST2僅在性腺中有表達(dá)；EST3和EST4的組織特異性相似，在心臟、鰓、腸、胃、肝臟和腎臟中均有表達(dá)；EST5僅在肝臟和腎臟中表達(dá)，且活性較弱。

2.1.7 山梨醇脫氫酶(SDH E.C.1.1.1.14)

在藍(lán)點(diǎn)馬鮫9種組織中共檢測到3種SDH酶帶(圖1g)。SDH1和SDH2僅在肝臟中表達(dá)，且活性較強(qiáng)；SDH3僅在腸和腎臟中表達(dá)，在腎臟中活性較強(qiáng)。

在藍(lán)點(diǎn)馬鮫9種組織中共檢測到5種MEP酶帶(圖1h)。MEP1在心臟、肌肉、胃、肝臟、性腺和腎臟等組織中均有表達(dá)；MEP2僅在鰓中表達(dá)；MEP3僅在肝臟中表達(dá)；MEP4在心臟和性腺中表達(dá)；MEP5在心臟、肝臟、眼和性腺中有表達(dá)，但活性都較弱。

2.2 藍(lán)點(diǎn)馬鮫雌雄個體組織的同工酶譜比較

比較雌雄個體LDH同工酶在9種組織中的表達(dá)模式(圖2)，發(fā)現(xiàn)LDH同工酶的表達(dá)在雌雄個體間沒有差別。其他同工酶在雌雄個體中的表達(dá)類似。

圖2 藍(lán)點(diǎn)馬鮫LDH同工酶雌雄對比電泳圖譜(左雌右雄)Fig.2 Electropherogram comparision of Scomberomorus niphonius LDH isozymes between male and female(female on the left and male on the right)(圖譜上方數(shù)字分別表示:1—心臟；2—鰓；3—腸；4—肌肉；5—胃；6—肝臟；7—眼睛；8—性腺；9—腎臟。)(The numbers at the top of the graph indicate: 1—heart; 2—gill; 3—intestine; 4—muscle; 5—stomach; 6—liver; 7—eye; 8—gonad; 9—kidney.)

3 討論

3.1 藍(lán)點(diǎn)馬鮫同工酶表達(dá)具有組織特異性

通過對藍(lán)點(diǎn)馬鮫9種組織中8種同工酶進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，同工酶表達(dá)的組織特異性主要表現(xiàn)在兩個方面，一是在同一組織中不同的酶活性不同。在腎臟中未檢測到GDH，其余7種酶均能檢測到，但活性差別較大。在鰓和性腺中未檢測到GDH和SDH，而其余6種酶均能檢測到。在肝臟中8種同工酶均能檢測到，LDH和SOD的活性不高，而其余6種同工酶的活性很高。在對卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)的研究中發(fā)現(xiàn)，在肝臟中，EST、MDH和ME均能檢測到，并且活性很高，而LDH的活性很低[23]。在對鱸魚的研究中也有類似的發(fā)現(xiàn)[3]。馬鮫魚、卵形鯧鲹和鱸魚都屬于鱸形目，說明在鱸形目魚類中，同一組織中存在的酶系統(tǒng)的進(jìn)化是相對保守的。在肝臟中檢測到多種的同工酶，可能是因?yàn)楦闻K是重要的物質(zhì)代謝場所，行使復(fù)雜的生理功能。二是同一種酶在不同組織中的表達(dá)存在差異。例如LDH，MDH和G6DPH在9種組織中都可以檢測到，但表達(dá)強(qiáng)度相差很大。LDH在肌肉和肝臟中的活性較弱；在大多數(shù)組織中只有1個條帶，但在眼睛中檢測出多個條帶，表明LDH同工酶在眼中存在多個結(jié)構(gòu)形態(tài)。MDH在眼睛中的表達(dá)與其他組織相比較弱，在心臟，腎臟和肝臟等組織中活性較強(qiáng)。G6DPH在肝臟中的活性較強(qiáng)，在其余8種組織中的活性都很弱。同工酶在不同組織中表達(dá)存在差異的情況也存在于其它魚類，如鱸魚[3]、大彈涂魚[4]等。

3.2 藍(lán)點(diǎn)馬鮫同工酶表達(dá)的特異性與功能的關(guān)系

LDH為糖酵解酶，能催化丙酮酸生成乳酸[24]，由A、B和C 3個基因位點(diǎn)編碼，LDH-A編碼的酶多在厭氧組織中表達(dá)，LDH-B編碼的酶多在含氧組織中表達(dá)[25-26]，LDH-C基因存在組織特異性[27]。LDH是由A、B兩個亞基隨機(jī)組合成的四聚體，不同結(jié)構(gòu)形式在電泳時形成各種不同的條帶。LDH在藍(lán)點(diǎn)馬鮫9種組織中共檢測出7條酶帶，LDH1只在肌肉中檢測到，可能是由LDH-A基因編碼形成的，催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，參與無氧代謝。LDH2在9種組織中均有表達(dá)，LDH3～LDH7只在眼睛中檢測到，并且LDH7的活性很高，推測LDH7是由LDH-C基因編碼形成，LDH3～LDH6為雜合帶。

MDH為二聚體酶，主要參與三羧酸循環(huán)過程。MDH分為上清液型(s-MDH)和線粒體型(m-MDH)，分別由2個等位基因控制，m-MDH主要使蘋果酸脫氫，s-MDH主要使胞液中的草酰乙酸還原而穿入線粒體[28-29]。電泳條件下s-MDH的泳動速度比m-MDH快[6]。在本實(shí)驗(yàn)中MDH在藍(lán)點(diǎn)馬鮫9種組織中共檢測出7條酶帶，MDH1～MDH4為線粒體型，MDH5～MDH7為上清液型。MDH在心臟、肝臟和腎臟等多種組織含量豐富，其中m-MDH在肌肉、心臟、胃、肝臟、性腺和腎臟中活性較強(qiáng)，這與肌肉等組織在三羧酸循環(huán)過程中把蘋果酸轉(zhuǎn)為草酰乙酸所需要的大量能量密切相關(guān)，而糖原能通過酵解和有氧分解迅速釋放大量能量[4]。

GDH屬于短鏈脫氫酶，它具有4個相同亞基，主要存在于動物的肝臟[30-31]，在高等動物脊椎動物中GDH只在肝臟中表達(dá)[30]，能夠催化D-葡萄糖成為D-葡萄糖酸內(nèi)酯，同時還原NAD(P)+為NAD(P)H。在本實(shí)驗(yàn)中，GDH雖然在藍(lán)點(diǎn)馬鮫的肝臟和眼組織中檢測到，但主要在肝臟中表達(dá)，在眼中活性較弱。

G6DPH為二聚體，是磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶，協(xié)助葡萄糖進(jìn)行新陳代謝，催化NADP還原生成NADPH[32]。在藍(lán)點(diǎn)馬鮫9種組織中共檢測到3種G6PDH酶帶，其中肝臟的G6DPH活性最強(qiáng)，其次是腎臟，在其他組織中的活性較弱，這可能與肝臟和腎臟具有旺盛的糖代謝功能相關(guān)。在動物骨骼肌中基本缺乏磷酸戊糖途徑，而在脂肪組織、腎上腺皮質(zhì)中，大部分葡萄糖是通過此途徑分解的，肝臟中也可通過此途徑進(jìn)行糖代謝[32]，因此在肝臟、腎臟以及脂肪等組織中可能含有較多的G6DPH。

SOD為二聚體酶，是一種重要的防御酶，其功能主要是清除機(jī)體的超氧自由基，維持機(jī)體正常的生理功能[33]。在藍(lán)點(diǎn)馬鮫9種組織中只檢測到1種SOD酶帶，與其他魚類中所報道的多條酶帶有所差異，如在松江鱸魚(Trachidermusfasciatus)7種組織中檢測到3種酶帶[34]，這可能與同工酶在不同物種中的差異性表達(dá)有關(guān)。SOD酶在肝臟組織中的活性最強(qiáng)，可能與其在肝臟中參與各種生物分子旺盛代謝產(chǎn)生的氧自由基的清除有關(guān)。

EST為單體或二聚體酶，大多數(shù)為單體，通常由2個以上的等位基因控制，其多態(tài)現(xiàn)象非常普遍，條帶多且復(fù)雜。EST是水解酶類，能催化脂類化合物水解，維持細(xì)胞正常的生理代謝[24]。在藍(lán)點(diǎn)馬鮫9種組織中共檢測到5種EST酶帶，其在肝臟和腎臟中的活性最強(qiáng)，具有明顯的組織特異性，這可能與魚類肝臟和腎臟中代謝旺盛，具有代謝廢物和毒素解毒功能有關(guān)。

SDH能可逆地催化D-山梨醇氧化為D-果糖，在山梨醇代謝過程中發(fā)生重要作用，主要分布于肝臟、腎、腦、心和脾等組織中且含量極少，血清中此酶活力很低，如酶活力升高，強(qiáng)烈提示肝損害[35]。在藍(lán)點(diǎn)馬鮫9種組織中共檢測到5種SDH酶帶，僅在腸、肝臟和腎臟中有活性，其中在腎臟中活性最強(qiáng)，在肝臟中活性較弱，在腸中極弱，在其余組織中則不表達(dá)，說明在腎臟中SDH可能參與了較多的山梨醇代謝過程。

MEP是催化蘋果酸生成丙酮酸的酶，它在胞液內(nèi)催化蘋果酸脫羧，其產(chǎn)生的NADPH可用于脂肪酸的合成，將糖酵解和檸檬酸循環(huán)聯(lián)系起來[36]，因此在機(jī)體代謝旺盛的器官和組織中含量較高。在藍(lán)點(diǎn)馬鮫9種組織中共檢測到5種MEP酶帶，在心臟、肝臟和腎臟中活性最高，這可能與這些組織物質(zhì)代謝旺盛有關(guān)。MEP在鰓和眼中的含量極低，說明在這2種組織中，可能不需要大量的糖代謝和脂肪酸合成。

3.3 不同性別馬鮫魚的同工酶譜比較

在本研究中，不同性別的藍(lán)點(diǎn)馬鮫8種同工酶在9種組織中的表達(dá)酶譜沒有差別?？讜澡?等[37]對鱸形目鱖亞科9種魚類的LDH同工酶進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)LDH同工酶表型具有明顯的種間差異，但同種的個體及性別之間沒有明顯差異。李凱彬 等[38]在研究鳉形目的RR-B 系劍尾魚(Xiphophorushelleri)時發(fā)現(xiàn)，不同性別的劍尾魚其LDH酶譜和GDH酶譜是一致的。熊全沫 等[39]對鯉形目中國胭脂魚(Myxocyprinusasiaticus)的5種酶進(jìn)行研究，其酶譜沒有性別的差異，這些研究與我們的結(jié)果一致。而龐秋香 等[7]對鯉形目的泰山赤鱗魚的研究表明，MEP的表型在不同性別間存在明顯差異。龐秋香 等[40]對文昌魚目的文昌魚(Branchiostomabelcheritsingtauense)研究發(fā)現(xiàn)MEP、MDH和酸性磷酸酶(EAP)表型在雌性和雄性個體之間存在差異，認(rèn)為這3種酶的合成可能是受性別連鎖基因控制或是受激素和不同的生理狀態(tài)控制。同工酶都是基因表達(dá)的產(chǎn)物，其表達(dá)調(diào)控受多種因素影響，在本研究中的8種同工酶在藍(lán)點(diǎn)馬鮫中的表達(dá)可能不受性別連鎖基因的控制。

4 結(jié)論

通過垂直聚丙烯酰胺凝膠技術(shù)，對象山港藍(lán)點(diǎn)馬鮫9種組織中8種同工酶的酶譜分析表明，MDH、EST和MEP三種同工酶在組織中表達(dá)具有多態(tài)性，GDH和SDH只在特定的組織中表達(dá)，而雌雄個體組織間同工酶的表達(dá)沒有差別。同工酶表達(dá)的組織特異性主要表現(xiàn)在兩個方面：一是在同一組織中不同的酶活性不同，二是同一種酶在不同組織中的表達(dá)有差異。這幾種同工酶的差異性表達(dá)可為藍(lán)點(diǎn)馬鮫的種質(zhì)鑒定和遺傳學(xué)分析等方面提供理論依據(jù)。