毛俐慧，金亮，丁華僑，董青，胡偉，田丹青

(浙江省園林植物與花卉研究所，浙江 杭州 311251)

基因組大小是指生物單倍體基因組的DNA含量，又稱DNAC值。基因組大小是生物體的基本生物學(xué)屬性，同屬物種間各異。根據(jù)英國(guó)邱園網(wǎng)站的數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cvalues.science.kew.org)，現(xiàn)已有12 273種植物有DNAC值數(shù)據(jù)，其中包括被子植物10 770種，裸子植物421種，蕨類植物303種，苔蘚植物334種，藻類445種。姜荷花(Curcumaalismatifolia)隸屬于姜黃屬，是一種熱帶觀賞花卉，原產(chǎn)于泰國(guó)和印度，因其形態(tài)如蓮，常作佛教用花。于2000年左右引進(jìn)中國(guó)，在西雙版納、海南等熱帶地區(qū)，以及廣東、廣西、福建等南亞熱帶地區(qū)適應(yīng)良好。近些年本課題組在姜荷花種球抗寒、繁殖等方面做了一系列的工作[1-2]，使其在江浙滬甚至長(zhǎng)江流域地區(qū)的栽培、越冬等技術(shù)難題得到解決。目前，姜荷花已經(jīng)在我國(guó)園林、盆栽等方面有廣泛應(yīng)用，其花葶高度適中(40～60 cm)，也是重要的切花。姜黃屬植物多數(shù)分布在印度和泰國(guó)，兩地分別都有40種以上，鑒于還沒(méi)有系統(tǒng)的分類修訂，該屬總種數(shù)還不十分清楚，估計(jì)有100種左右主要分布于南亞、東南亞，少數(shù)在中國(guó)、澳大利亞、南太平洋地區(qū)[3]。姜黃屬植物許多物種都具有較高經(jīng)濟(jì)、藥用、觀賞價(jià)值，最被熟知的姜黃(C.longaL.)是重要的香料，也可做藥用，具有抗癌、抗炎、降血脂等功效。姜黃屬已有33種植物具有基因組大小數(shù)據(jù)，該屬植物基因組大小介于0.83 pg(Curcumavamana)與2.38 pg(Curcumaoligantha)[4]，然而姜荷花作為新興的重要觀賞花卉，基因組大小還未知。

流式細(xì)胞術(shù)是進(jìn)行快速定量分析分選單個(gè)細(xì)胞液體流的技術(shù)[5]。利用熒光染料對(duì)細(xì)胞核內(nèi)DNA進(jìn)行染色，檢測(cè)核DNA含量，分析植物倍性，目前已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用[6-8]。本研究擬測(cè)定姜荷花的基因組大小，為基因組學(xué)研究、倍性育種研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

姜荷花清邁粉的幼苗種植于浙江省園林植物與花卉研究所大棚，摘取新鮮嫩葉作為實(shí)驗(yàn)材料。參考標(biāo)準(zhǔn)為蘿卜Saxa(RaphanussativusL.Saxa)，來(lái)自捷克科學(xué)院實(shí)驗(yàn)植物研究所，其基因組大小為2C=1.11 gp，1C=543 Mbp。該材料種植于浙江省園林植物與花卉研究所光照培養(yǎng)間，摘取新鮮嫩葉作為標(biāo)準(zhǔn)植株的實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 姜荷花細(xì)胞核懸液的制備與DNA染色

采用CyStain PI Absolute P(Sysmex-Partec，05-5022)試劑盒提取細(xì)胞核并染色。取少量姜荷花清邁粉新鮮嫩葉，蒸餾水清洗，濾紙擦拭，將葉片放入加有0.5 mL裂解液的培養(yǎng)皿中，用雙面刀片快速切碎葉片，靜置5 min，用30 μm過(guò)濾器過(guò)濾獲得細(xì)胞核懸液。在制備好的細(xì)胞核懸液中加入染色液(含PI，RNase)，避光染色5 min。采用同樣方法制備蘿卜細(xì)胞核懸液。

1.2.2 上機(jī)檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析

采用CyFlow Ploidy Analyser(德國(guó)Sysmex-Partec)流式細(xì)胞儀進(jìn)行基因組大小分析。該機(jī)配備532 nm綠色激光器。每個(gè)樣品檢測(cè)細(xì)胞核數(shù)至少為5 000個(gè)。檢測(cè)所得數(shù)據(jù)用ModFit LT(美國(guó)Verity Software House公司)軟件進(jìn)行分析。先檢測(cè)蘿卜細(xì)胞核懸液樣本，再檢測(cè)姜荷花、蘿卜數(shù)量比1∶1混合細(xì)胞核懸液。姜荷花的基因組大小計(jì)算公式為：姜荷花C值=(姜荷花峰的熒光強(qiáng)度均值/蘿卜Saxa峰的熒光強(qiáng)度均值)×蘿卜Saxa的C值。

2 結(jié)果與分析

流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果見圖1，通過(guò)比較G0/G1期的峰值，可得出姜荷花基因組大小。姜荷花清邁粉的基因組大小是蘿卜Saxa的1.84倍，蘿卜Saxa基因組大小為543 Mbp，可估算出姜荷花清邁粉的基因組大小約為998.5 Mbp(1C=88.89/48.43×543=998.5 Mbp)，即C值為1.02 pg。圖中紅色和黃色主峰的峰值分別是蘿卜和姜荷花的G0/G1期的峰值。

圖1 姜荷花清邁粉基因組流式細(xì)胞儀分析 檢測(cè)結(jié)果

3 討論

基因組大小是生物體重要的特性參數(shù)，研究發(fā)現(xiàn)，基因組大小與植物對(duì)氮水添加的響應(yīng)、對(duì)氣候的適應(yīng)，以及植物的入侵性大小都具有相關(guān)性。小基因組植物地上凈初級(jí)生產(chǎn)力(ANPP)對(duì)氮水添加響應(yīng)更敏感，水和氮水共同添加使DNAC值小的植物ANPP顯著增加[9]。對(duì)單子葉植物核DNA含量與氣候的適應(yīng)性分析表明，在中等溫度和雨量環(huán)境下，核DNA含量最高，溫度和水分趨向極端的環(huán)境下其核DNA含量較低[10]。入侵植物常具有更小的DNAC值，統(tǒng)計(jì)的47種入侵雜草的DNAC值平均為1.76 pg，極顯著小于非雜草性草本植物(6.75 pg)[11]。

不同物種植物的基因組大小不同，對(duì)25種鳶尾屬植物的流式細(xì)胞儀測(cè)定表明，該屬基因組大小為2.62～6.77 pg[12]。依據(jù)邱園網(wǎng)站提供的資料，姜黃屬植物的DNAC值為0.83～2.38 pg。有研究綜述前人的研究結(jié)果表明，植物種內(nèi)甚至存在基因組大小的變異，這些變異通常和生態(tài)功能的分化相關(guān)，緯度、海拔、營(yíng)養(yǎng)條件、光照等可能會(huì)對(duì)基因組大小產(chǎn)生一定的影響[13]。本研究?jī)H測(cè)定了單一地理來(lái)源的姜荷花清邁粉的基因組大小，對(duì)姜荷花的基因組大小尚沒(méi)有全面的認(rèn)識(shí)，后續(xù)研究可以對(duì)姜荷花不同品種，以及同個(gè)品種不同群體的樣本進(jìn)行基因組大小測(cè)定，從而對(duì)姜荷花基因組大小有更全面的了解。

本研究用流式細(xì)胞儀，豐富了姜荷花的生物學(xué)特征資料，為姜荷花基因組測(cè)序提供了必要的參考數(shù)據(jù)，也為倍性育種結(jié)果檢測(cè)提供了參考依據(jù)。同時(shí)為姜科其他物種的基因組大小測(cè)定提供技術(shù)和方法上的參考。