黃尾全，王丹麗，呂安琪，黃銀萍

（1.東莞市厚街醫(yī)院，廣東東莞523945；2.廈門大學(xué)附屬翔安醫(yī)院，福建廈門361101）

白癜風(fēng)是一種常見的特發(fā)性疾病，其特征是黑素細(xì)胞的破壞[1]。雖然除皮膚上的褪色斑點(diǎn)外很少有任何身體癥狀，但白癜風(fēng)患者生活質(zhì)量受損[2]。已經(jīng)提出自身免疫，細(xì)胞毒性代謝物，神經(jīng)和遺傳理論來解釋色素喪失的機(jī)制[3]。除黑素細(xì)胞功能障礙外，角質(zhì)形成細(xì)胞改變也起作用，脫色表皮中的角質(zhì)形成細(xì)胞比正常皮膚更容易受細(xì)胞凋亡影響并產(chǎn)生較少量的黑素原介質(zhì)[4]。然而，這種色素性疾病的確切機(jī)制仍然未知，這阻礙了其治療進(jìn)展。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是大約22個(gè)核苷酸長(zhǎng)的非編碼基因調(diào)節(jié)RNA分子，其通過靶mRNA的降解和翻譯抑制來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后多個(gè)基因的表達(dá)[5]。miRNA調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞發(fā)育并參與自身免疫發(fā)育[6]。miRNA在外周血中保存良好，可作為疾病預(yù)測(cè)，診斷，預(yù)后和治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物[7]。miRNA已經(jīng)在人體中深入研究了10多年，并且已被發(fā)現(xiàn)可調(diào)節(jié)大多數(shù)細(xì)胞過程，包括細(xì)胞增殖，分化，發(fā)育，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，代謝，凋亡和免疫應(yīng)答[8]。miRNA失調(diào)與各種炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，包括不同的炎癥性皮膚病，如牛皮癬，特應(yīng)性皮炎和過敏性接觸性皮炎[9]。關(guān)于miRNA在白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制中的作用知之甚少。本研究的目的是研究miR-155、miR-1238-3p、miR-202-3p、miR-630 和 miR-766-3p 在白癜風(fēng)患者外周血中的表達(dá)改變與病情進(jìn)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本次研究選取2018年1月—2019年1月來我院治療和檢查的62例白癜風(fēng)患者，平均年齡（23.25±2.11）歲，男 30例（48.39%），女 32例（51.61%），其中白癜風(fēng)穩(wěn)定期患者44例（71.77%），白癜風(fēng)進(jìn)展期患者18例（28.23%）。選取與白癜風(fēng)組性別、年齡和體質(zhì)量指數(shù)匹配的55例健康者作為對(duì)照。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①性別不限；②被診斷為早期、中期和后期白癜風(fēng)患者；③色素脫失斑或色素減退斑與周圍正常皮膚界限清楚且形狀不規(guī)則患者；④年齡7～48歲。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①排除其他原因?qū)е碌纳販p退或脫失造成的白斑；②其他自身免疫疾病患者；③心腦血管嚴(yán)重疾病患者；④精神疾病患者。

1.1.3 倫理檢查 所有參與者均簽署書面知情同意書。本研究中描述的試驗(yàn)方案經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，并按照指南進(jìn)行。所有試驗(yàn)均完全符合政府政策和指導(dǎo)方針。

1.2 方法

1.2.1 外周血樣本 外周血樣本取自東莞市厚街醫(yī)院皮膚科，在無菌條件下，通過靜脈穿刺采集3 mL全血樣品收集到肝素化真空采血管（BD公司，美國）中。對(duì)照組血樣經(jīng)系統(tǒng)檢測(cè)沒有白癜風(fēng)或任何其他自身免疫疾病。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR） 定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)使用TRIzol試劑（賽默飛世爾科技公司，美國）分離總RNA，并根據(jù)制造商的方案用RNeasy Mini Kit（凱杰公司，德國）純化。每個(gè)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)由 0.5 μg RNA，2 μL miScriptHiSpec緩沖液，11 Ml NucleicsMix 和 0.5 μL miScriptReverse TranscriptaseMix（凱杰公司，德國）組成，總體積為10 μL。反應(yīng)在 GeneAmp PCRSystem 9700（應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，美國）中于37℃進(jìn)行60 min，然后在95℃下加熱滅活5 min。然后將10 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物在無核酸酶的水中稀釋10倍并保持在-20℃。使用LightCycler 480實(shí)時(shí)PCR儀器（羅氏制藥有限公司，上海）進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，其中含有10 μL PCR反應(yīng)混合物，其包含 1 μL cDNA，5 μL QuantiFast SYBR Green PCR Kit（凱杰公司，德國），0.2 μL通用引物（凱杰公司，德國），0.2 μL miRNA特異性引物和3.6 μL無核酸酶水。將反應(yīng)物在384孔光學(xué)板（羅氏制藥有限公司，上海）中于95℃溫育5 min，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃10 s和60℃30 s。每個(gè)樣品一式3份進(jìn)行分析。將miRNA的表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化以輸入?yún)⒖蓟虿⑹褂?-ΔΔct方法計(jì)算。見表1。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡 將外周血樣本在提取緩沖液中勻漿，由 100 mM Tris緩沖液（pH 7.4），100 mM 焦磷酸鈉，100 mM氟化鈉，10 mM EDTA，10 mM原釩酸鈉，2 mM苯甲基磺酰氟，0.1 mg抑肽酶和1%組成。Triton X-100，在4℃下使用TE-103小樣品均化器以30 000轉(zhuǎn)/min離心30 s。然后將樣品以12 000轉(zhuǎn)/min在4℃下離心（海蒂詩公司，德國）30 min，并使用由實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化的Bradford方法測(cè)量每個(gè)樣品中的蛋白質(zhì)濃度。將20 μg蛋白質(zhì)的等分試樣煮沸保持5 min，以8 000轉(zhuǎn)/min快速離心10 s，并施加到含有0.1%緩沖液（SDS）和運(yùn)行緩沖液（SDS-PAGE）的15%聚丙烯酰胺凝膠上。通過電泳以100 V的恒定電流強(qiáng)度分離蛋白質(zhì)約2 h。然后將蛋白質(zhì)條帶在轉(zhuǎn)移緩沖液中在120℃下在4℃電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上90 min，然后用Molico?脫脂乳封閉，持續(xù)搖動(dòng)30 min。接下來，將膜在4℃下與在3%PBS/BSA中1∶100稀釋的初級(jí)抗miR-155、miR-1238-3p、miR-202-3p、miR-630、miR-766-3p和β-actin抗體一起溫育過夜。第2天，用pH7.4的0.01M PBS緩沖液洗滌膜，并與在3%PBS/BSA中以1∶2 000稀釋的過氧化物酶綴合的第二抗山羊抗體孵育2 h。再次洗滌膜，并施加1組化學(xué)發(fā)光試劑5 min。使用配備有Image Lab軟件（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，上海）的ChemiDoc XRS+成像儀顯影和拍照。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA） 通過ELISA法檢測(cè)腫瘤壞死因子（TNF）-α，干擾素（IFN）-γ，IFN-α和白細(xì)胞介素（IL）-1β含量。根據(jù)試劑盒的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或作為抗凝劑，然后加入10%（v/v）抗凝劑（0.1 M檸檬酸鈉或1%heparin或2.0%EDTA.Na2）混合大約 15 min后，在（3 000轉(zhuǎn)/min）離心機(jī)下離心20 min左右，收集樣本上清液。然后將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，加如樣品時(shí)時(shí)間控制在15 min內(nèi)。然后進(jìn)行室溫溫育、洗滌。加入底物后定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化，避免反應(yīng)過強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。每個(gè)樣本設(shè)置至少3個(gè)重復(fù)。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.5 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平 根據(jù)制造商的說明，使用ROS測(cè)定試劑盒檢測(cè)ROS的細(xì)胞內(nèi)形成。將外周血與10 μM DCFH-DA探針在37℃下孵育35 min，并用PBS洗滌3次以除去殘留的探針。DCFH-DA通過非特異性酯酶在細(xì)胞內(nèi)脫乙?；?，其被ROS進(jìn)一步氧化成熒光化合物2，7-二氯熒光素（2'，7'-Dichlorofluorescein，DCF）。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCF熒光，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm。使用熒光顯微鏡，流式細(xì)胞儀或激光共聚焦顯微鏡等檢測(cè)熒光信號(hào)（BD公司，美國）。根據(jù)其熒光信號(hào)強(qiáng)度，可分析活性氧的真正水平。通過Cell Quest軟件（BD公司，美國）分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0（美國IBM公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料采用百分率（%）表示，組間比較采用 χ2分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者情況統(tǒng)計(jì) 白癜風(fēng)組與健康對(duì)照組相比性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、糖尿病患者比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），排除上述因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成的影響，數(shù)據(jù)有可比性。見表2。

2.2RT-qPCR分析miR相關(guān)基因mRNA的表達(dá) 與健康對(duì)照組相比，白癜風(fēng)穩(wěn)定期和白癜風(fēng)進(jìn)展期miR-155 mRNA表達(dá)量均增加，miR-1238-3p、miR-202-3p、miR-630和miR-766-3p mRNA表達(dá)量均降低（P＜0.05）。并且白癜風(fēng)進(jìn)展期miR-155 mRNA表達(dá)量增加幅度最大，miR-1238-3p、miR-202-3p、miR-630和miR-766-3p mRNA表達(dá)量降低幅度最大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1、表3。

表2 患者一般情況統(tǒng)計(jì) 例（%）

2.3 蛋白質(zhì)免疫印跡分析miR相關(guān)基因蛋白的表達(dá) 相較于健康對(duì)照組，白癜風(fēng)穩(wěn)定期和白癜風(fēng)進(jìn)展期均能使白癜風(fēng)患者外周血中miR-155蛋白表達(dá)量增加，miR-1238-3p、miR-202-3p、miR-630 和miR-766-3p蛋白的表達(dá)量減少（P＜0.05）。同時(shí)，隨著白癜風(fēng)病程發(fā)展，miR-155蛋白表達(dá)量逐漸增加，miR-1238-3p、miR-202-3p、miR-630 和 miR-766-3p蛋白表達(dá)量逐漸降低（P＜0.05）。白癜風(fēng)進(jìn)展期miR-155蛋白表達(dá)量高于白癜風(fēng)穩(wěn)定期，miR-1238-3p、miR-202-3p、miR-630 和 miR-766-3p 蛋白表達(dá)量低于白癜風(fēng)穩(wěn)定期（P＜0.05）。見表4。

2.4 細(xì)胞中炎性因子含量測(cè)定 相較于健康對(duì)照組，白癜風(fēng)穩(wěn)定期和白癜風(fēng)進(jìn)展期均能使TNF-α、IFN-γ、IFN-α 和 IL-1β 含量增加，同時(shí)，隨著白癜風(fēng)病程發(fā)展，TNF-α、IFN-γ、IFN-α 和 IL-1β 含量逐漸增加，白癜風(fēng)進(jìn)展期TNF-α、IFN-γ、IFN-α和IL-1β含量高于白癜風(fēng)穩(wěn)定期（P＜0.05）。見表5。

表3 miR相關(guān)基因mRNA表達(dá)量 （iu/mL，±s）

表3 miR相關(guān)基因mRNA表達(dá)量 （iu/mL，±s）

組別 miR-155 miR-1238-3p miR-202-3p miR-630 miR-766-3p健康對(duì)照組 1.24±0.23 2.78±0.55 3.54±0.65 1.86±0.53 4.37±0.87白癜風(fēng)穩(wěn)定期 2.36±0.47 1.92±0.14 2.77±0.38 1.53±0.31 3.57±0.69白癜風(fēng)進(jìn)展期 7.37±1.05 0.12±0.05 0.29±0.06 0.13±0.08 0.85±0.22 F 13.587 12.647 11.523 16.987 15.327 P 0.005 0.012 0.006 0.025 0.000

表4 miR相關(guān)基因蛋白表達(dá)量 （kDa，±s）

表4 miR相關(guān)基因蛋白表達(dá)量 （kDa，±s）

組別 miR-155 miR-1238-3p miR-202-3p miR-630 miR-766-3p健康對(duì)照組 1.37±0.22 3.54±0.64 2.87±0.34 4.87±0.68 4.23±0.38白癜風(fēng)穩(wěn)定期 2.15±0.34 2.67±0.37 2.22±0.28 3.92±0.54 3.52±0.44白癜風(fēng)進(jìn)展期 5.27±0.52 0.12±0.08 0.05±0.02 1.08±0.19 0.83±0.11 F 15.398 16.248 13.254 11.156 15.274 P 0.013 0.027 0.034 0.000 0.008

表5 TNF-α、IFN-γ、IFN-α 和 IL-1β 含量 （pg/mL，±s）

表5 TNF-α、IFN-γ、IFN-α 和 IL-1β 含量 （pg/mL，±s）

組別 TNF-α IFN-γ IFN-α IL-1β健康對(duì)照組 0.57±0.08 1.24±0.17 0.18±0.05 1.33±0.14白癜風(fēng)穩(wěn)定期 1.26±0.25 2.25±0.32 0.63±0.17 2.14±0.25白癜風(fēng)進(jìn)展期 4.16±0.38 5.26±0.57 3.14±0.47 5.47±0.55 F 16.374 15.226 13.147 14.238 P 0.008 0.014 0.025 0.000

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧含量 相較于健康對(duì)照組，白癜風(fēng)穩(wěn)定期和白癜風(fēng)進(jìn)展期活性氧含量均增加，同時(shí)，隨著白癜風(fēng)病程發(fā)展，活性氧含量逐漸增加，白癜風(fēng)進(jìn)展期活性氧含量高于白癜風(fēng)穩(wěn)定期（P＜0.05）。見表 6。

表6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量 （μmol/L，±s）

表6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量 （μmol/L，±s）

組別 ROS健康對(duì)照組 2.36±0.15白癜風(fēng)穩(wěn)定期 3.85±0.47白癜風(fēng)進(jìn)展期 8.18±0.56 F 15.134 P 0.013

3 討論

雖然在白癜風(fēng)患者中發(fā)現(xiàn)了大量差異表達(dá)的miRNA，但只有少數(shù)靶標(biāo)被確定，生物過程的潛在功能仍然未知，鑒定miRNA參與白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制并了解miRNA調(diào)節(jié)途徑對(duì)于開發(fā)基于miRNA的白癜風(fēng)診斷和治療策略至關(guān)重要。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)miR-25在白癜風(fēng)過度表達(dá)，能夠調(diào)節(jié)血清中的酪氨酸酶水平[10]。miR-196r-2多態(tài)性可以影響白癜風(fēng)患者的易感性[11]。miR-224-3p上調(diào)有助于促進(jìn)黑素細(xì)胞的變性[12]。在這項(xiàng)研究中，筆者嘗試在白癜風(fēng)患者的外周血樣本中分析差異表達(dá)的miRNA，并通過調(diào)節(jié)途徑提供已鑒定的miRNA的預(yù)測(cè)靶基因的生物學(xué)功能的描述。在定量RT-PCR驗(yàn)證后，確定4種 miRNA（miR-1238-3p，miR-202-3p，miR-630 和miR-766-3p）在白癜風(fēng)組中較低表達(dá)。這些miRNA的表達(dá)水平和潛在功能先前已在其他生理?xiàng)l件中描述。miR-155靶向細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子，并通過激活CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞中的干擾素信號(hào)傳導(dǎo)，miR-155的過表達(dá)有助于通過抑制黑色素生成相關(guān)基因的表達(dá)和改變黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞中IFN調(diào)節(jié)基因的白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制[13]。一些研究表明miR-202-3p在結(jié)直腸癌和胃癌中下調(diào)，這表明這種miRNA可能作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用[14]。miR-630的生物學(xué)功能通過與許多不同的調(diào)節(jié)因子相互作用與多種癌癥相關(guān)聯(lián)，并且主要在抑制侵襲，轉(zhuǎn)移和癌細(xì)胞生長(zhǎng)中發(fā)揮作用[15]。在這項(xiàng)研究中 ，miR-155 上 調(diào) ，miR-1238-3p，miR-202-3p，miR-630和miR-766-3p在白癜風(fēng)患者中被下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在某種程度上與之前的報(bào)道一致。miR-155在特應(yīng)性皮炎患者的皮膚中過度表達(dá)，主要是由于免疫細(xì)胞的存在[16]。在筆者的研究中，與黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的刺激實(shí)驗(yàn)一致，觀察到miR-155在損傷性白癜風(fēng)皮膚的表皮中增加。這表明白癜風(fēng)患者皮膚中炎性細(xì)胞因子的存在調(diào)節(jié)了炎性反應(yīng)并激活黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞中miR-155的表達(dá)。

TNF-α，IFN-α，IFN-γ 和 IL-1β 細(xì)胞因子與白癜風(fēng)發(fā)病有關(guān)[17]。筆者研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于健康對(duì)照組，白癜風(fēng)穩(wěn)定期和白癜風(fēng)進(jìn)展期均能使TNF-α、IFN-γ、IFN-α和IL-1β含量增加，且進(jìn)展期高于穩(wěn)定期（P＜0.05）。

黑素細(xì)胞變性的其他關(guān)鍵因素是由于細(xì)胞抗氧化劑受損和其他代謝異常而對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性增加[18]。最近報(bào)道，miR-211在非色素性黑色素瘤細(xì)胞中的異位表達(dá)通過miR-211依賴性轉(zhuǎn)錄后下調(diào)丙酮酸脫氫酶激酶4導(dǎo)致線粒體數(shù)量和氧消耗增加[19]。據(jù)報(bào)道，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也會(huì)影響線粒體代謝和ROS的產(chǎn)生，并參與白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制。最近，一些研究發(fā)現(xiàn)miRNA調(diào)節(jié)的基因網(wǎng)絡(luò)參與氧化應(yīng)激，自身免疫和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[20]。

筆者的研究結(jié)果顯示，相較于健康對(duì)照組，白癜風(fēng)穩(wěn)定期和白癜風(fēng)進(jìn)展期ROS含量均增加。miRNA以通過調(diào)節(jié)并介導(dǎo)ROS在某些疾病中的致病，結(jié)合筆者的研究結(jié)果提示miR-155、miR-1238-3p、miR-202-3p、miR-630 和 miR-766-3p 在白癜風(fēng)患者的外周血中失調(diào)，隨著白癜風(fēng)病程發(fā)展，miR-155表達(dá)量逐漸增加，miR-1238-3p、miR-202-3p、miR-630和miR-766-3p表達(dá)量逐漸降低。然而，需要進(jìn)一步的研究來闡明本研究中失調(diào)的miRNA是否是治療白癜風(fēng)的合適的診斷標(biāo)志物或靶標(biāo)。