黃海艷 ，杜娟 ，張杰 ，鄒彥芬 ，彭曦 ，王芳 ，于波 ，邵勇

（1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東深圳518036；2.北京大學(xué)人民醫(yī)院，北京100044）

白癜風(fēng)是一種獲得性進(jìn)行性的色素脫失性皮膚病，以局部表皮功能性黑素細(xì)胞缺失為主要特征，全世界的發(fā)病率大約在0.5%～1%[1]。最新的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紫鉚素及其衍生物可以抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞的免疫功能，促進(jìn)小鼠B16黑素瘤細(xì)胞和正常人黑素細(xì)胞黑素合成，但其具體分子機(jī)制尚不清楚[2-4]。有研究發(fā)現(xiàn)，AMPK通路在調(diào)節(jié)黑素生成過程中發(fā)揮著重要作用[5]，因此，本研究將紫鉚素作用于正常人黑素PIG1細(xì)胞，觀察紫鉚素對體外黑素合成的影響及其分子機(jī)制，為探討紫鉚素對白癜風(fēng)的治療作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 試劑 紫鉚素（#F4043），α-黑素細(xì)胞刺激素（MSH）購自美國Sigma公司；胰島素、氫化可的松、L-谷氨酰胺、L-Dopa（Sigma，美國）；DMEM 培養(yǎng)基（Gibco，美國）；乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；抗 β-actin、MITF、TRP-1、TRP-2、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）和P-AMPK抗體購自（Abcam，英國）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔二抗和鼠二抗購自美國CST公司；ECL發(fā)光液（Millipore，美國）；其他試劑均為分析純（南京化學(xué)試劑有限公司）；AICAR（#HY-13417）購自上海MCE公司。

1.1.2 儀器 生物安全柜（AC2-4S1型）、CO2培養(yǎng)箱（Celmate型）購自新加坡Esco公司；CKX71倒置熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；BS210S分析天平購自德國Sartorius公司；Varoskan Flash多功能酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher公司；Milli-Q純水儀購自美國Millipore公司；Tanon-5200全自動化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)購自上海天能。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 正常人黑素細(xì)胞系PIG1細(xì)胞，來源于正常人黑素細(xì)胞，基本生物學(xué)特性與正常人原代培養(yǎng)黑素細(xì)胞相似。由美國芝加哥大學(xué)Caroline Le Poole博士惠贈[6]。復(fù)蘇PIG1黑素細(xì)胞，加入含人黑素細(xì)胞生長添加劑HMGS及5%FBS的M254培養(yǎng)基，孵箱內(nèi)培養(yǎng)。0.25%胰蛋白酶消化傳代，細(xì)胞增殖良好，至80%左右融合時進(jìn)行實驗，光鏡下細(xì)胞呈樹突狀為生長良好。

1.2.2 分組及給藥 實驗分組：對照組，α-MSH組（300 nmol/L），紫鉚素低（10 nmol/L）、紫鉚素中（100 nmol/L）、紫鉚素高（1 μmol/L）劑量組，細(xì)胞加入藥物刺激后完全培養(yǎng)48 h。在檢測AMPK通路對黑素合成影響的實驗中，先給與1 μM AICAR處理細(xì)胞4 h后，再給與各種藥物處理48 h。

1.2.3 CCK-8法檢測紫鉚素對PIG1細(xì)胞活力的影響 選擇對數(shù)生長期的PIG1細(xì)胞，胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為0.5×106/mL接種于96孔板，每孔100μL。過夜培養(yǎng)后按2.2加入藥物培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μL CCK-8孵育2 h后，562 nm檢測吸光度。

1.2.4 LDH釋放法檢測紫鉚素對PIG1細(xì)胞的毒性選擇對數(shù)生長期的PIG1細(xì)胞，胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為0.5×106/mL接種于24孔板，每孔100 μL。按1.2.2加入藥物培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)基，按照乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒說明測定上清液中的LDH活性，在490 nm處測定吸光度。

1.2.5 NaOH裂解法檢測PIG1細(xì)胞黑素含量 選擇對數(shù)生長期的PIG1細(xì)胞，胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×106/mL接種于6孔板，按1.2.2加入藥物培養(yǎng)48 h后，每孔加入100 μL總蛋白抽提裂解液進(jìn)行勻漿，加入2倍體積的抽提液混勻。4℃，12 000轉(zhuǎn)/min離心10 min。溶液分上中下3層，上層棄去，中間層蛋白膜用于蛋白定量（BCA）法。下層黑素沉淀加入 350 μL 1 mol/L NaOH（含 10%DMSO），80 ℃裂解2 h，于405 nm處測定OD值，計算黑素相對含量。

1.2.6 L-Dopa氧化法檢測人皮膚組織酪氨酸酶（TYR）活力 選擇對數(shù)生長期的PIG1細(xì)胞，胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為0.5×106/mL接種于6孔板，每孔加入100 μL總蛋白抽提裂解液進(jìn)行勻漿，加入2倍體積的抽提液混勻，4℃，12 000轉(zhuǎn)/min離心10 min。溶液分上中下3層，取中間層蛋白膜用于蛋白定量（BCA）法。計算含10μg總蛋白的裂解液體積，用PBS（0.1 mol/L，pH 6.8）定量至 100 μL，再加入 100 μL 0.01%L-Dopa，37℃避光孵育 30 min，475 nm 處測定OD值。

1.2.7 Western blot法檢測黑素相關(guān)蛋白的表達(dá) 用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白濃度定量，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗在4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，室溫孵育二抗1 h，TBST洗滌3次，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，拍照。

1.2.8 RT-PCR 用Trizol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，最后進(jìn)行RT-qPCR檢測。以GAPDH為內(nèi)參計算mRNA相對表達(dá)量，引物序列為：

GAPDH 上游引物：5’-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3’，下游引物：5’-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3’；MITF 上游引物：5’-GCCTGTCTCGGGAAACTTGA-3’，下游引物：5’-ACGCTGTGAGCTCCCTTTTT-3’；TRY 上游引物：5’-CGAGTCGGATCTGGTCATGG-3’，下游引物：5’-GACACAGCAAGCTCACAAGC-3’。

PCR反應(yīng)體系為10 μL。反應(yīng)條件：95℃變性60 s，60℃退火 50 s，72℃延伸 60 s，擴(kuò)增 40個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 所有實驗結(jié)果采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（ONE-WAY ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫鉚素對PIG1細(xì)胞活性的影響 CCK-8檢測PIG1細(xì)胞活力結(jié)果顯示，300 nmol/L α-MSH能上調(diào) PIG1細(xì)胞活力至（1.89±0.32）倍（P=0.025），100 nmol/L和1 μmol/L紫鉚素能上調(diào)PIG1細(xì)胞活力至（1.45±0.22）倍（P=0.021）和（1.90±0.31）倍（P=0.032），不同濃度紫鉚素促進(jìn)PIG1細(xì)胞增殖作用還呈劑量依賴性。與對照組相比，300 nmol/L α-MSH和不同濃度的紫鉚素作用48hPIG1細(xì)胞釋放的LDH差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果顯示，α-MSH和紫鉚素能促進(jìn)PIG1細(xì)胞增殖，且不造成細(xì)胞毒性，見圖1。

圖1 α-MSH和紫鉚素對PIG1細(xì)胞活力和LDH釋放的影響

2.2 紫鉚素對PIG1細(xì)胞黑素合成及酪氨酸酶活性的影響 與對照組相比，300 nmol/L α-MSH，100 nmol/L和1 μmol/L紫鉚素作用48 h后，PIG1細(xì)胞黑色素含量分別上調(diào)（1.49±0.09）倍（P=0.009），（1.35±0.22）倍（P=0.027）和（1.59±0.11）倍（P=0.031），酪氨酸酶活力分別上調(diào)（1.29±0.08）倍（P=0.014），（1.15±0.17）倍（P=0.015）和（1.28±0.13）倍（P=0.015）。見圖2。

圖2 α-MSH和紫鉚素對PIG1細(xì)胞黑色素含量和酪氨酸酶活性的影響

2.3 紫鉚素對PIG1細(xì)胞黑素合成相關(guān)蛋白和mRNA表達(dá)的影響 MITF是黑素合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，并能調(diào)控黑素相關(guān)蛋白TRP-1和TRP-2的表達(dá)。與對照組相比，α-MSH能顯著上調(diào)MITF、TRP1和TRP2的蛋白和mRNA表達(dá)水平，紫鉚素劑量依賴性的促進(jìn)MITF和TRP-1、TRP-2的蛋白和mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，α-MSH通過上調(diào)TYR活力及MITF調(diào)控的黑素相關(guān)蛋白的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞黑素合成，見圖3。

圖3 α-MSH和紫鉚素對PIG1細(xì)胞黑素相關(guān)蛋白（MITF、TRP-1、TRP-2）及其 mRNA 表達(dá)的影響

2.4 α-MSH和紫鉚素抑制PIG1細(xì)胞AMPK通路 AMPK是調(diào)節(jié)黑素生成的重要激酶。結(jié)果顯示，與對照組相比，300 nmol/L α-MSH和紫鉚素能劑量依賴性地抑制AMPK的磷酸化水平，見圖4。

圖4 α-MSH和紫鉚素對PIG1細(xì)胞AMPK通路的影響

2.5 紫鉚素通過AMPK通路調(diào)節(jié)PIG1細(xì)胞黑素合成相關(guān)蛋白和mRNA表達(dá) AICAR是AMPK通路特異性激動劑，能顯著刺激AMPK的磷酸化水平。1 μmol/L AICAR能顯著抑制α-MSH和紫鉚素對PIG1細(xì)胞MITF、TRP1和TRP2蛋白水平的上調(diào)作用，并抑制MITF和TRY的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果表明，α-MSH和紫鉚素都可通過AMPK通路調(diào)節(jié)PIG1細(xì)胞黑素合成途徑。見圖5。

2.6 AMPK通路激動劑對PIG1細(xì)胞黑素合成及酪氨酸酶活性的影響 結(jié)果顯示，用AICAR激活PIG1細(xì)胞AMPK通路，能夠顯著抑制α-MSH和紫鉚素誘導(dǎo)的PIG1細(xì)胞黑素合成增加和酪氨酸酶活性上調(diào)作用。結(jié)果表明，α-MSH和紫鉚素可以通過AMPK通路促進(jìn)PIG1細(xì)胞黑素合成，見圖6。

3 討論

圖5 AICAR對PIG1細(xì)胞黑素合成相關(guān)蛋白及其mRNA表達(dá)的影響

圖6 AICAR對PIG1細(xì)胞黑素合成及酪氨酸酶活性的影響

白癜風(fēng)是一種常見的色素脫失性疾病，由于其確切的病因尚未找到，目前還沒有一種完全有效的治療方法。紫鉚素是從菊科植物驅(qū)蟲斑鳩菊（Vernonia Anthelmintica Willd）的成熟果實中提取的一種黃酮類成分，紫鉚素及其衍生物有抑制免疫、促進(jìn)黑色素合成的作用[7-8]，然而具體機(jī)制仍不清楚。本研究通過培養(yǎng)正常人黑素細(xì)胞PIG1，探討紫鉚素對皮膚黑素合成功能的影響及可能的作用機(jī)制。

首先，筆者觀察了紫鉚素對PIG1細(xì)胞潛在的毒性作用。300 nM α-MSH及不同劑量的紫鉚素作用PIG1細(xì)胞后，可促進(jìn)細(xì)胞增殖，但對LDH釋放量無顯著影響，見圖1，這表明該研究劑量下的紫鉚素對PIG1有增殖促進(jìn)作用，且不引起毒性。

為了探討紫鉚素促進(jìn)PIG1細(xì)胞黑素合成的分子機(jī)制，筆者檢測了紫鉚素對黑素合成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。TYR是黑素合成的限速酶，據(jù)文獻(xiàn)報道其活性和表達(dá)直接影響黑素合成[9-10]。MITF是黑素合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，并調(diào)控黑素相關(guān)蛋白TYR、TRP-1、TRP-2的表達(dá)，最終影響黑素合成[11]。結(jié)果顯示，紫鉚素劑量依賴性的促進(jìn)人皮膚組織的TYR活性與黑素含量，見圖3，上調(diào)黑素相關(guān)蛋白TYR、TRP-1、TRP-2及MITF的表達(dá)，見圖4。

AMP依賴的蛋白激酶（AMPK）是調(diào)節(jié)生物能量恒定性的重要傳感分子，能激活上游激酶LKB1、CaMKKβ和Takl等。AMPK的活性受AMP/ATP比值的調(diào)節(jié)，可調(diào)控能量代謝的分解與合成通路，調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的代謝和血管功能，促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和脂肪酸氧化等[12]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，AMPK通路在調(diào)節(jié)黑素合成方面同樣發(fā)揮著重要作用。脂聯(lián)素和AICAR可以激活A(yù)MPK通路，進(jìn)而下調(diào)正常人和小鼠黑素細(xì)胞中的MITF，酪氨酸酶，TRP-1和DCT表達(dá)并降低黑素含量[4]。二甲雙胍通過激活A(yù)MPK通路減少cAMP含量和cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）磷酸化導(dǎo)致小鼠黑素細(xì)胞瘤B16-F10細(xì)胞和正常人黑素細(xì)胞（NHM）中的黑素含量降低，這種抑制作用與黑素生成、MITF、酪氨酸酶、多巴色素互變異構(gòu)酶和TRP1等基因的表達(dá)降低相關(guān)[13]。但是紫鉚素是否能夠通過影響AMPK活性調(diào)節(jié)黑素合成尚未有所報道。

與之前的研究結(jié)果相一致，α-MSH和紫鉚素能夠抑制PIG1細(xì)胞中AMPK活性，用AMPK特異性激動劑AICAR后，α-MSH和紫鉚素促進(jìn)PIG1細(xì)胞黑素合成的作用消失。結(jié)果表明，紫鉚素促進(jìn)PIG1細(xì)胞黑素合成的機(jī)制是通過抑制AMPK信號通路。

本研究探討驅(qū)蟲斑鳩菊中紫鉚素促進(jìn)黑素合成的分子機(jī)制。紫鉚素通過抑制AMPK活性促進(jìn)表皮黑素細(xì)胞的增殖及上調(diào)MITF及其調(diào)控的黑素合成相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)人PIG1細(xì)胞的黑素合成。然而，目前紫鉚素及其衍生物對色素代謝及色素性皮膚病治療的具體機(jī)制尚未完全闡明，仍需進(jìn)一步的探究。