何海寧，張 微，嚴 峰，史琰琛，王靜華，肖世富，王 濤

上海交通大學醫(yī)學院附屬精神衛(wèi)生中心老年精神科，上海交通大學阿爾茨海默病診治中心，上海 200030

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種常見的老年疾病，隨著我國老齡化進程的加速，由該病帶來的醫(yī)療護理和經(jīng)濟負擔問題將日益嚴峻。AD 的主要病理特征為腦內(nèi)β 淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉積和神經(jīng)纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangle，NFT）[1]。然而近10 年來，針對上述病理機制開發(fā)的藥物Ⅲ期臨床試驗均紛紛宣告失敗，包括Aβ 單克隆抗體[2-3]、tau 蛋白拮抗劑[4]、β/γ-分泌酶抑制劑[5-6]等，這提示我們需要進一步研究AD 的病理機制以制定有效的干預策略。研究[7-9]顯示，AD 的認知衰退過程是一個疾病連續(xù)譜，AD 所致輕度認知功能損害（mild cognitive impairment，MCI）期（MCI due to AD）是AD 所致癡呆（dementia due to AD）的前驅(qū)期，也是早期干預的最佳切入點。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類小分子單鏈非編碼RNA，可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達[10]。在神經(jīng)元中特異表達的miRNA 是促進神經(jīng)元生長發(fā)育、分化成熟和保持突觸功能的關(guān)鍵因子，對維持神經(jīng)穩(wěn)態(tài)發(fā)揮了重要作用[11-12]。既往研究[13-14]表明，AD 患者體內(nèi)的某些特定miRNA 可通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因[如淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）、淀 粉 樣 前 體 蛋 白β 位 點 裂 解酶1（β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1，BACE1）等]參與AD 的病理過程，這可能是AD 的發(fā)病機制之一。目前，大部分研究都僅針對AD 患者，鮮少有針對AD 的前驅(qū)期——AD 所致MCI 患者的報道。而在疾病早期開展相關(guān)miRNA 的表達及其調(diào)控機制的研究，將有助于深入了解AD 的早期發(fā)病機制，亦可為其早期藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。

基于此，本研究通過對受試者的外周血血漿行miRNA 芯片測序，分析篩選出在AD 所致MCI 組血漿中顯著上調(diào)的miRNA，并對miRNA 的預測靶基因進行生物信息學分析，以探究miRNA 在AD 早期病理過程中的 作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象及其資料收集

本研究的納入對象篩選自中國縱向老齡化隊列研究（China Longitudinal Aging Study，CLAS）數(shù)據(jù)庫。CLAS的臨床研究注冊號為NCT03672448，該研究經(jīng)上海交通大學醫(yī)學院附屬精神衛(wèi)生中心倫理委員會批準，并獲得了所有受試者和/或其法定監(jiān)護人的書面知情同意。

本研究共納入10 例研究對象，其中AD 所致MCI 患者5 例（AD 所致MCI 組），認知功能正常老人5 名（對照組）。AD 所致MCI 組入組標準：①年齡60 ～90 歲。②符合2011 年美國國立衰老研究所和阿爾茨海默病協(xié)會（National Institute Aging and Alzheimer's Association，NIA-AA）修訂指南中“AD 所致MCI-中度可能”的診斷標準[9]。③18F-Flumetamol 正電子發(fā)射計算機斷層掃描（positron emission tomography，PET）檢測Aβ 陽性。排除標準：①軀體疾病、酒精、藥物或理化因素所致的認知功能損害。②存在重性精神疾病或嚴重軀體疾病。③存在嚴重視力、聽力障礙，不能配合完成認知功能評估。對照組入組標準：①年齡60 ～90 歲。②認知功能正常。排除標準：①存在重性精神疾病或嚴重軀體疾病。②存在嚴重視力、聽力障礙，不能配合完成認知功能評估。

收集所有受試者的人口學基本資料，包括性別、年齡和受教育年限，并采用蒙特利爾認知評估量表（Montreal Cognitive Assessment，MoCA）對患者的認知功能進行 評估。

1.2 樣本收集及RNA 提取

每位受試者空腹12 h 后，采集其靜脈血于EDTA 抗凝管中，4 ℃、1 207×g離心20 min 后，收集上層血漿。使用TRIzol 試劑（Invitrogen，美國）提取血漿RNA，具體操作步驟按照說明書進行。隨后，使用NanoDrop 1000（Thermo Fisher，美國）測定RNA 純度，吸光度比值 [D（260 nm） /D（280 nm）]在1.8 ～2.1 之間即為純度達標。

1.3 miRNA 芯片測序及分析

采用miRCURYLNATMmiRNA 芯片（Exiqon 公司，丹麥）探測受試者血漿樣本中miRNA 的表達情況，根據(jù)使用說明書進行操作。使用Axon GenePix 4000B 芯片掃描儀掃描芯片，GenePix Pro 6.0 讀取芯片掃描圖像，提取探針的信號值。相同的探針信號值取中值合并，保留所有樣本中均≥30.0 的探針值，對全部芯片進行中值標準化。使用獨立樣本t檢驗比較AD 所致MCI 組和對照組的組間差異。差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）的對數(shù)（log2FC） ≥ 1 被定義為上調(diào)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義，同時符合這2 個標準的miRNA 即為顯著上調(diào)miRNA。

本研究采用的芯片含有3 100 種探針，覆蓋所有在miRBase 19.0 數(shù)據(jù)庫中注釋的人、小鼠和大鼠的miRNA，同時也包括這些物種相關(guān)的病毒miRNA。此外，還有25個獨有的miRPlus 的人源miRNA 沒有被收錄在miRBase數(shù)據(jù)庫中。

1.4 miRNA 的靶基因預測

顯著上調(diào)miRNA 的靶基因采用TargetScan 7.2 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）進行預測，即通過搜索和miRNA 種子區(qū)域相匹配的保守8mer 和7mer 位點來預測其靶基因[15]，并根據(jù)cumulative weighted context++ scores 預測靶基因可信度，該分數(shù)值越低提示預測可信度 更高。

1.5 miRNA-基因相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵miRNA 篩選

miRNA-基因相互作用網(wǎng)絡(luò)可使多個miRNA 與靶基因的相互作用可視化，尋找調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵miRNA 及關(guān)鍵基因。采用Cytoscape 軟件構(gòu)建miRNA-基因相互作用網(wǎng)絡(luò)，分析miRNA 與靶基因之間的相互作用。靶基因的篩選閾值為cumulative weighted context++ score＜-0.6，刪去預測可信度低的靶基因，使最終的網(wǎng)絡(luò)能更直接地突出關(guān)鍵節(jié)點。采用CytoNCA 計算網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點的連接（degree，DC）值，刪去DC 值＜2 的基因節(jié)點，得到核心網(wǎng)絡(luò)；以cumulative weighted context++ scores 為加權(quán)值，計算DC 值，篩選核心網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵miRNA。

1.6 關(guān)鍵miRNA 靶基因的功能分析

基因本體數(shù)據(jù)庫（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome，KEGG）通路分析是描述基因生物學功能的常用方法[16]。使用R 語言分析包對核心網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵miRNA 的靶基因進行GO 富集分析和KEGG 通路分析，采用Benjamini-Hochberg 方法對多次比較的P值進行校正，以P＜0.01 篩選富集分析條目和通路信息。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 軟件對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的定量資料以±s表示，采用獨立樣本t檢驗進行分析；定性資料以頻數(shù)和百分比表示，采用χ2檢驗分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 受試者人口學資料及臨床資料比較

結(jié)果（表1）顯示，2 組受試者在年齡、性別、受教育年限及MoCA 評分間差異均無統(tǒng)計學意義。

表1 2 組受試者人口學資料和臨床資料比較Tab 1 Comparison of demographic and clinical data between the two group

2.2 血漿miRNA 的表達情況

根據(jù)log2FC 和P值篩選顯著上調(diào)的miRNA，結(jié)果（表2）顯示，與對照組相比，AD 所致MCI 組的外周血血漿中存在13 個顯著上調(diào)的miRNA，且均為人源性（hsamiR）。顯著上調(diào)miRNA 的表達情況如圖1。

表2 AD 所致MCI 組患者的外周血血漿中顯著上調(diào)的miRNATab 2 Significantly up-regulated miRNAs in peripheral blood plasma of MCI due to AD group

圖1 AD 所致MCI 組患者的外周血血漿miRNA 的表達情況Fig 1 Expression of miRNAs in peripheral blood plasma of MCI due to AD group

2.3 miRNA-基因相互作用網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵miRNA 篩選

miRNA-基因相互作用網(wǎng)絡(luò)如圖2A，其中hsa-miR-550a-3p、hsa-miR-424-3p 獨立于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，與其他miRNA無相互作用。移除DC 值＜2 的基因節(jié)點和2 個獨立的miRNA 節(jié)點后得到核心網(wǎng)絡(luò)，即包括11 個miRNA 和65 個基因節(jié)點（圖2B）。在核心網(wǎng)絡(luò)中計算以cumulative weighted context++ scores 加 權(quán) 的DC 值，排 在 前5 位 的miRNA 分別為hsa-miR-3202、hsa-miR-4443、hsa-miR-4747-5p、hsa-miR-4722-5p 和hsa-miR-5194。該5 個miRNA 被確定為調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵miRNA。DC 值＞2 的基因節(jié)點有CCHC 型鋅指核酸結(jié)合蛋白（CCHC-type zinc finger nucleic acid binding protein，CNBP）、泛素相關(guān)修飾物1（ubiquitin related modifier 1，URM1）、序列相似的83 家族 成 員F（family with sequence similarity 83 member F，F(xiàn)AM83F）、跨膜蛋白14（tetraspanin 14，TSPAN14）、視黃素（retbindin，RTBDN）、包含S1 的pleckstrin 同源結(jié)構(gòu)域（pleckstrin homology domain containing S1，PLEKHS1）和argonaute RISC 催 化 組 分2（argonaute RISC catalytic component 2，AGO2），這7 個 關(guān) 鍵 基 因 被2 個 及 以 上miRNA 同時調(diào)控。

2.4 關(guān)鍵miRNA 的靶基因GO 富集分析

GO 富集分析結(jié)果（圖3）顯示，hsa-miR-3202 的靶基因主要涉及突觸可塑性的調(diào)節(jié)、Wnt 信號通路、甲基化依賴的基因沉默等生物學過程，hsa-miR-4722-5p 的靶基因主要涉及高爾基體小囊泡的轉(zhuǎn)運過程、多巴胺轉(zhuǎn)運、抗原的加工提呈等生物學過程，hsa-miR-4747-3p 的靶基因主要涉及神經(jīng)遞質(zhì)運輸、突觸間囊泡轉(zhuǎn)運、突觸間囊泡定位等生物學過程，hsa-miR-5194 的靶基因主要涉及miRNA 前體（pre-miRNA）的翻譯、谷氨酸受體信號通路、肌動蛋白纖維聚合、囊泡運輸?shù)壬飳W過程，hsamiR-4443 的靶基因主要涉及I-κB 激酶/NF-κB 通路和調(diào)節(jié)淋巴細胞、單核細胞增殖等生物學過程。

2.5 關(guān)鍵miRNA 的靶基因KEGG 通路分析

KEGG 通路分析結(jié)果（圖4）顯示：hsa-miR-3202的靶基因主要參與Ras 信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路和糖酵解/糖異生等通路，hsa-miR-4722-5p 的靶基因主要參與Ras 信號通路、細胞因子受體信號通路和胰島素信號通路等，hsa-miR-4747-3p 的靶基因主要參與MAPK 信號通路、糖酵解/糖異生、嘌呤代謝等通路，hsa-miR-5194的靶基因主要參與低氧誘導因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信號通路、趨化因子信號通路和細胞內(nèi)吞作用等通路，hsa-miR-4443 的靶基因主要參與Ras 信號通路、氧化磷酸化、磷酸戊糖途徑、果糖/甘露糖代謝等 通路。

圖2 miRNA-基因相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig 2 miRNA-target gene interaction network

圖3 關(guān)鍵miRNA 的靶基因GO 富集分析Figure 3 GO enrichment analyses of target genes of key miRNAs

圖 4 關(guān)鍵miRNA 的靶基因KEGG 通路分析Fig 4 KEGG pathway analyses of target genes of key miRNAs

3 討論

目前，AD 的生物標志物主要分為腦脊液相關(guān)蛋白標志物（Aβ42、Aβ40、總tau 蛋白和磷酸化tau 蛋白）和神經(jīng)影像學檢測到的相關(guān)標志物（Aβ PET、結(jié)構(gòu)磁共振成像顯示的腦萎縮）[17-18]。其中，腰椎穿刺獲取腦脊液樣本為有創(chuàng)操作，神經(jīng)影像學檢查費用較為昂貴，無法大規(guī)模應(yīng)用于臨床。然而目前，血液樣本的獲取相對簡便，且為無創(chuàng)或微創(chuàng)操作，較適用于AD 的早期篩查和診斷。本研究針對AD 所致MCI 患者的血漿miRNA 進行芯片測序及生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)有13 個顯著上調(diào)的miRNA，其中5 個關(guān)鍵miRNA 參與了AD 的早期病理過程，或可作為早期診斷AD 所致MCI 的潛在生物標志物。同時，本研究納入的AD 所致MCI 患者均經(jīng)18F-Fluementamol PET 金標準確診，提升了臨床診斷的可靠性[9]。但上述miRNA的血漿表達水平尚需進一步驗證，將其作為生物標志物用于診斷AD 所致MCI 的診斷效力仍需大樣本臨床研究加以證實。

本研究針對關(guān)鍵miRNA 的靶基因進行GO 富集分析發(fā)現(xiàn)，其主要參與突觸可塑性的調(diào)節(jié)、Wnt 信號通路、突觸間囊泡轉(zhuǎn)運、突觸間囊泡定位等生物學過程。突觸損傷是AD 疾病過程的早期事件，即在早期AD 患者和MCI 患者的大腦新皮層和海馬中均存在突觸連接喪失和突觸數(shù)量減少的情況[19-20]。海馬是記憶形成的關(guān)鍵腦區(qū)，海馬中的突觸損傷與認知能力下降密切相關(guān)。因此，我們推測hsamiR-3202 和hsa-miR-4747-3p 可能通過抑制突觸可塑性的調(diào)節(jié)、突觸間囊泡轉(zhuǎn)運和囊泡定位等生物學過程造成突觸損傷，進而引起AD 的發(fā)生。Wnt 信號通路主要參與細胞增殖、細胞凋亡、軸突導向、突觸形成和神經(jīng)細胞再生等生物學過程[21-22]。近年來研究[23-24]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路廣泛參與神經(jīng)元的增殖、分化、凋亡和突觸可塑性調(diào)節(jié)，在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮了重要作用。Tapia-Rojas等[25]研究發(fā)現(xiàn)，抑制Wnt 信號通路可以誘導海馬中Wnt 信號通路成分的改變和功能的喪失，從而引發(fā)tau 蛋白磷酸化和Aβ1-42 水平升高，造成APP 轉(zhuǎn)基因小鼠認知下降。因此，本研究結(jié)果提示hsa-miR-3202 可能通過抑制Wnt 信號通路，參與AD 早期的病理過程。另外，我們注意到hsamiR-5194 參與調(diào)節(jié)miRNA 前體的翻譯，提示hsa-miR-5194可能參與調(diào)控一些AD 相關(guān)miRNA 的表達。

KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)，關(guān)鍵miRNA 的靶基因主要參與Ras 信號通路、MAPK 信號通路、糖酵解/糖異生、磷酸戊糖途徑、果糖/甘露糖代謝等通路。研究[26-34]顯示，Ras 信號通路和MAPK 信號通路在AD 病理過程中起著重要作用。MAPK 是一組能被不同細胞外刺激激活的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要由細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2）、氨基末端激酶（Jun N-terminal kinase，JNK）和p38-MAPK 共3 條信號轉(zhuǎn)導途徑組成。腦內(nèi)MAPK/ERK 信號通路參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元的增殖和凋亡，且ERK 信號傳導可激活糖原合成激酶-3（glycogen synthesis kinase-3，GSK-3），造成APP和tau 蛋白磷酸化，與AD 的病理機制密切相關(guān)[26]。ERK的激活也可造成線粒體形態(tài)和功能異常，增強氧化應(yīng)激反應(yīng)[27]。而對AD 患者腦組織進行尸檢后發(fā)現(xiàn)，p38-MAPK在與學習和記憶相關(guān)的腦區(qū)中高度表達[28]，且其激活的發(fā)生是在疾病的早期[29-30]。p38-MAPK 的激活可導致細胞內(nèi)鈣、活性氧產(chǎn)生，線粒體應(yīng)激增加[31]。且體外研究[32]表明，p38-MAPK 可促進神經(jīng)細胞凋亡。而Ras 蛋白可作為信號通路的分子開關(guān)，調(diào)控下游MAPK 信號通路；Ras/MAPK 級聯(lián)通路可參與海馬區(qū)CA1、杏仁核、齒狀回以及其他涉及學習和記憶的區(qū)域中突觸可塑性的調(diào)節(jié)[33]。同時，Ras 信號通路也可直接參與神經(jīng)元生長發(fā)育過程，促進皮層神經(jīng)元之間的突觸形成[34]。因此，針對本研究預測的上調(diào)miRNA 在體內(nèi)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和潛在的調(diào)控機制，我們推測該miRNA 可能通過調(diào)節(jié)這些相關(guān)的通路參與AD的發(fā)病過程。

總之，本研究首次提出了AD 所致MCI 患者的血漿中存在hsa-miR-3202 等13 種上調(diào)miRNA，其或可作為潛在的生物標志物用于對AD 所致MCI 的診斷研究；同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，在miRNA-基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中存在5 個關(guān)鍵miRNA，其上調(diào)可能是AD 發(fā)生的重要因素。通過調(diào)控相關(guān)通路影響AD 的發(fā)生與發(fā)展，對AD 治療的藥物靶點研究和發(fā)病機制研究具有重要意義。

參·考·文·獻

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