張雙雙,崔憶旋,劉學寶,許彬彬,蔡常琦,朱慧慧,韓亞娟,丁曉嬌,韓躍峰*,趙 報#

(1蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,蚌埠 233000;2蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤內科;*通訊作者,E-mail:hanyf1015@126.com;#共同通訊作者,E-mail:zhaobao86@126.com)

下咽癌是一種少見的頭頸部惡性腫瘤,約占頭頸部惡性腫瘤的3%-5%,其病理類型以鱗狀細胞癌為主[1,2]。下咽癌往往發(fā)現(xiàn)比較晚,70%-85%的病例診斷時已經屬于Ⅲ期或Ⅳ期。下咽癌生物學特性惡劣,發(fā)生部位隱蔽難察覺,且極易發(fā)生頸部淋巴結轉移,預后差,生存率低[3,4]。盡管對下咽癌的手術治療、放療、化療及靶向藥物治療取得了重要進展,但下咽癌患者的預后尚無明顯改善。因此,有必要尋找與下咽癌治療進展相關的新策略。

上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是細胞重塑的一個重要過程,其特征是上皮表型的逐漸喪失和間充質表型的逐步增加,EMT不是一個全有或全無的過程,而是上皮細胞向中間細胞狀態(tài)的間充質細胞的轉變[5]。腫瘤轉移是延長癌癥患者壽命的主要障礙,上皮-間質轉化(EMT)在腫瘤侵襲、浸潤和轉移形成等致癌過程中起著重要作用,對腫瘤的侵襲和轉移尤為重要[6]。上皮標志物如E-cadherin和間充質標志物包括N-cadherin和vimentin的表達水平被用來定義上皮-間充質狀態(tài)[7]。EMT轉錄因子snail是一種EMT的調控因子,其抑制上皮基因的表達[8]。實驗證明,處于EMT中間狀態(tài)的癌細胞在轉移過程中表現(xiàn)出更強的侵襲性,從而形成集體癌簇以克服壓力環(huán)境[9]。因此,確定更多的EMT藥物靶點作為癌癥治療手段將是發(fā)展抗癌治療的必要條件。

NAD(P)H ∶醌氧化還原酶1(NQO1)蛋白又稱醌氧化還原酶,既是一種保護細胞免受氧化損傷的黃素酶,也是人體內一種非常重要的化學致癌物代謝酶[10]。β-拉帕醌(β-lapachone),分子量242.273 8 g/mol,是NQO1蛋白的一種有效抑制劑,從中南美洲天然產物紫檀樹的樹皮中分離獲得[11]。β-拉帕醌的生物學作用廣泛,包括抗細菌、抗真菌、殺錐蟲、抗銀屑病、消炎和抗腫瘤等作用[12]。并且對多種癌細胞具有良好的抗腫瘤作用,包括肝癌、乳腺癌、胰腺癌等[13]。然而其在下咽癌中的作用及機制尚不清楚。因此,本文以下咽癌Fadu細胞株為實驗對象,體外分析β-拉帕醌對下咽癌細胞增殖、遷移的抑制作用,并初步探討其分子作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人下咽癌Fadu細胞株購自武漢普諾塞生命科技有限公司,培養(yǎng)于蚌埠醫(yī)學院藥學院生化實驗室。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(含EDTA)及雙抗(青霉素/鏈霉素)均購自美國Hyclone公司,胎牛血清(FBS)購自浙江天杭生物科技股份有限公司,MTT試劑、雙染細胞凋亡檢測試劑盒(Annexin Ⅴ-FITC/PI)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、Transwell小室均購自上海碧云天生物技術有限公司,一抗(Bcl-2、Bax、E-cadherin、vimentin、Snail)、β-actin及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔/鼠二抗均購自于美國CST公司等。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人下咽癌細胞Fadu培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中,在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞長至70%-80%時消化傳代。

1.2.2 MTT實驗檢測細胞存活率 取對數(shù)期生長狀態(tài)良好的Fadu細胞消化,離心,棄上清,制成細胞懸液計數(shù)后接種于96孔板,調整培養(yǎng)液為100 μl/孔,細胞數(shù)約為1×104個/孔,于培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)內培養(yǎng)過夜。待細胞長至密度達80%左右,向96孔板內分別加入濃度為0,1,2,3,4,5,6 μmo1/L的β-拉帕醌溶液,每組設5個復孔,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,每孔加入配制好的MTT溶液15 μl,MTT濃度為5 g/L,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,小心吸去培養(yǎng)液,每孔加入150 μl DMSO,繼續(xù)于培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)中培養(yǎng)30 min后,在490 nm波長處用酶聯(lián)免疫檢測儀測吸光度值(OD490 nm)。計算細胞存活率:細胞存活率(%)=實驗組OD490 nm/對照組OD490 nm×100%。取平均值繪制藥物劑量效應曲線,并計算藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50),實驗重復3次取平均值,篩選適宜的藥物作用濃度。

1.2.3 平板克隆實驗檢測細胞增殖 取對數(shù)期生長狀況良好的Fadu細胞消化,離心,棄上清,制成細胞懸液計數(shù)后接種于6孔板,調整培養(yǎng)液為2 ml/孔,細胞數(shù)約為5 000個/孔,于培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)內培養(yǎng)24 h后,向6孔板內分別加入濃度為0,2,4,6 μmo1/L的β-拉帕醌溶液,再放入培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)2周;待細胞生長至出現(xiàn)肉眼可見的細胞集落時,終止細胞培養(yǎng);棄去培養(yǎng)基,用預先冷卻的PBS溶液清洗2遍后,每孔滴加1 ml 4%多聚甲醛溶液固定15-20 min;棄去固定液,然后向每孔中滴加1 ml 結晶紫染色15-20 min;回收保留結晶紫,用自來水洗滌6孔板3次,自然風干并拍照。使用軟件Image J計算細胞克隆數(shù)。

1.2.4 Transwell實驗檢測細胞遷移 取對數(shù)期生長狀態(tài)良好的Fadu細胞消化,離心,棄上清,用無血清的DMEM培養(yǎng)液制成細胞懸液計數(shù)后,將約含2×105個細胞/ml的無血清細胞懸液加入100 μl至上層小室,并在上層小室中分別加入濃度為0,2,4,6 μmol/L的β-拉帕醌溶液,在下層小室內加入600 μl的DMEM完全培養(yǎng)液,于培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)內培養(yǎng)48 h后,丟棄上室液體,將小室放入雙蒸水中輕輕洗滌1遍后,再將小室放入含600 μl 4%多聚甲醛溶液的24孔板中固定15-20 min,丟棄固定液,將小室放入雙蒸水中洗滌1遍后,再將小室放入含600 μl結晶紫的24孔板中染色15-20 min,回收保留結晶紫,再將小室放入雙蒸水中洗滌1遍,用棉簽擦拭小室內。最后,用光學顯微鏡200倍放大觀察并拍照。使用軟件Image J計算細胞遷移數(shù)。

1.2.5 流式細胞術(Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染法)檢測細胞凋亡 取對數(shù)期生長狀態(tài)良好的Fadu細胞消化,離心,棄上清,制成細胞懸液計數(shù)后接種于6孔板,調整培養(yǎng)液為2 ml/孔,細胞數(shù)約為5×105個/孔,于培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)內培養(yǎng)24 h后,向6孔板內分別加入濃度為0,2,4,6 μmo1/L的β-拉帕醌溶液,于培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,用不含EDTA的胰酶消化細胞并收集細胞,其中空白孔(0 μmo1/L組)分為4份,分別為空白對照組、PI組、Annexin Ⅴ-FITC組以及對照組。500g離心5 min,棄上清,用預冷的PBS清洗2遍,每組加入200 μl Annexin Ⅴ-FITC結合液混勻,再加入1.5 μl Annexin Ⅴ-FITC染色液輕輕混勻,在4 ℃冰箱中避光孵育15 min;之后再加入1.5 μl PI染色液,在4 ℃冰箱中避光孵育5 min,1 h內,用流式細胞儀分析檢測細胞凋亡率,激發(fā)波長488 nm;發(fā)射波長530 nm。此實驗重復3次。

1.2.6 Western blot法檢測Bcl-2、Bax、E-cadherin、vimentin、Snai1蛋白表達水平 將對數(shù)期生長狀態(tài)良好的Fadu細胞用不同濃度的β-拉帕醌溶液處理,濃度分別為0,2,4,6 μmol/L,于培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)中繼續(xù)培養(yǎng),48 h后將細胞消化收集至離心管,PBS洗滌2遍后,加入含有PMSF的裂解液冰上裂解30 min,放入-20 ℃冰箱過夜,次日離心30 min(12 000 r/min,30 min),棄去沉淀,取上清液。用BCA法測出蛋白濃度,然后加入上樣緩沖液,并計算出每組樣本所需上樣量。將蛋白總量相同的樣本加入到蛋白凝膠(SDS-PAGE)內進行蛋白分離,待溴酚藍到達凝膠的底部后終止,將凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h于室溫搖床上搖晃,用TPBS洗滌5 min,重復3次。用一抗稀釋液分別稀釋Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)、E-cadherin(1 ∶1 000)、vimentin(1 ∶1 000)、Snail(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶2 000)一抗,將PVDF膜放于不同的一抗中4 ℃孵育過夜,次日室溫下在搖床上搖晃30 min后,用TPBS洗膜,洗滌5 min,重復3次,再將PVDF膜放入二抗中室溫孵育2 h于搖床上搖晃,之后用TPBS洗膜5 min,重復3次。最后ECL發(fā)光試劑盒顯色、成像。β-actin蛋白作為內參。使用軟件Image J分析各組條帶灰度值,計算目標蛋白條帶灰度值/內參條帶灰度值的比值。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 8軟件對實驗結果進行分析,實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示,各組間差異采用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較各組間差異,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 β-拉帕醌對Fadu細胞存活率的影響

MTT實驗結果顯示,當濃度為0,1,2,3,4,5,6 μmol/L的β-拉帕醌作用于Fadu細胞48 h,隨著β-拉帕醌濃度的增加Fadu細胞的存活率降低,與0 μmol/L相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖1),作用48 h的IC50值為3.547 μmol/L。表明β-拉帕醌對Fadu細胞具有抑制增殖的作用且呈濃度依賴性。

2.2 β-拉帕醌對Fadu細胞增殖的影響

平板克隆實驗結果顯示,Fadu細胞經濃度為0,2,4,6 μmol/L的β-拉帕醌處理2周后,隨著β-拉帕醌濃度的增加Fadu細胞的克隆形成數(shù)量明顯減少,與0 μmol/L相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01,見圖2)。提示β-拉帕醌可顯著抑制Fadu細胞的克隆能力,且呈濃度依賴性。

與0 μmol/L相比,*P<0.05圖1 不同濃度β-拉帕醌作用48 h對Fadu細胞存活率的影響Figure 1 Effect of different concentrations of β-lapachone for 48 h on the survival rate of Fadu cells

圖2 不同濃度β-拉帕醌作用2周對Fadu細胞增殖的影響Figure 2 Effect of different concentrations of β-lapachone for 2 weeks on the proliferation of Fadu cells

2.3 β-拉帕醌對Fadu細胞遷移的影響

Transwell實驗結果顯示,隨著β-拉帕醌濃度的增加,Fadu細胞的遷移數(shù)量逐漸減少,與0 μmol/L相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01,見圖3)。表明β-拉帕醌可顯著抑制Fadu細胞遷移,且呈濃度依賴性。

圖3 不同濃度β-拉帕醌作用48 h對Fadu細胞遷移的影響Figure 3 Effect of different concentrations of β-lapachone for 48 h on migration of Fadu cells

2.4 β-拉帕醌對Fadu細胞凋亡的影響

Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染實驗,流式分析結果顯示不同濃度的β-拉帕醌(0,2,4,6 μmol/L)作用于Fadu細胞24 h,細胞發(fā)生凋亡,并且隨著藥物濃度的增加,細胞凋亡率明顯增高,與0 μmol/L相比,不同濃度藥物作用后細胞凋亡率差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01,見圖4)。提示β-拉帕醌可顯著誘導Fadu細胞凋亡。

圖4 不同濃度β-拉帕醌作用24 h對Fadu細胞凋亡的影響Figure 4 Effect of different concentrations of β-lapachone for 24 h on apoptosis of Fadu cells

2.5 β-拉帕醌對Fadu細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax及EMT相關蛋白E-cadherin、vimentin、Snai1表達的影響

Western blot結果顯示,與0 μmol/L相比,不同濃度的β-拉帕醌(2,4,6 μmol/L)作用于Fadu細胞48 h,Bcl-2、vimentin、Snail蛋白表達量明顯下降(P<0.05或P<0.01),Bax、E-cadherin蛋白表達量明顯上升(P<0.05或P<0.01,見圖5)。表明β-拉帕醌可下調凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達并上調凋亡誘導蛋白Bax的表達,與此同時,下調EMT間質標志物vimentin、Snai1蛋白的表達和上調EMT上皮標志物E-cadherin蛋白的表達。

與0 μmol/L相比,*P<0.05,**P<0.01;與2 μmol/L相比,#P<0.05,##P<0.01;與4 μmol/L相比,&P<0.05圖5 Western blot檢測不同濃度β-拉帕醌對Fadu細胞Bcl-2、Bax、E-cadherin、vimentin、Snail蛋白表達的影響Figure 5 Effect of different concentrations of β-lapachone on the expression of Bcl-2,Bax,E-cadherin,vimentin,Snail in Fadu cells by Western blot

3 討論

在所有頭頸部惡性腫瘤中,下咽癌的生存率最低,總體預后差,95%以上的下咽癌患者被證實為鱗狀細胞癌,通常表現(xiàn)為黏膜表面的病變[14]。下咽癌在其行為上通常具有侵襲性,并表現(xiàn)出一種自然史,其特征是彌漫性原發(fā)腫瘤伴黏膜和黏膜下局部擴散,早期頸部淋巴結轉移,以及相對較高的遠端擴散率[15]。目前下咽癌的治療方式以手術治療為主,但由于術后復發(fā)、遠處轉移等原因,治療效果不理想。尋找新的藥物來治療下咽癌成為科研工作者研究的熱點。

在過去的30年里,天然化合物的藥用價值一直很高,并且一直是癌癥治療的主要藥物[16]。天然化合物β-拉帕醌(β-lapachone)化學名為3,4-二氫-2,2-二甲基-2H-萘并[1,2-b]-吡喃-5,6-二酮,屬于1,2-萘醌類[17]。β-拉帕醌為新型抗癌候選藥物,是一種有力的細胞毒性劑,顯示出對多種腫瘤細胞的殺傷作用[18]。但其在下咽癌細胞中的作用及機制尚不清楚,本研究旨在探討β-拉帕醌對下咽癌細胞的抗癌作用,為此本研究在體外進行了一系列實驗探討β-拉帕醌對下咽癌細胞的作用及相關機制。

細胞不受控制的增殖與腫瘤的整體進展密切相關,而許多惡性腫瘤細胞通過凋亡逃逸獲得無限的增殖能力[19]。促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白平衡的破壞是凋亡逃逸的一種機制[20]。而Bcl-2基因家族與細胞凋亡的關系密切,如家族中的抗凋亡成員Bcl-2、促凋亡蛋白Bax[21]。因此,通過調控凋亡的關鍵蛋白或酶的表達或功能來誘導癌細胞凋亡成為癌癥研究的熱點[22]。因此,本實驗從細胞的增殖、凋亡和遷移等方面著手設計,觀察β-拉帕醌處理后相關基因蛋白表達水平的變化,以期探索可能的作用機制。經β-拉帕醌處理后,由MTT實驗及克隆形成實驗的結果可知,β-拉帕醌對下咽癌Fadu細胞具有明顯的增殖抑制作用,且呈濃度依賴性。由Tranwell實驗結果和流式細胞儀分析結果可知β-拉帕醌還可以抑制下咽癌Fadu細胞的遷移并誘導細胞凋亡。Woo等[23]報道表明,β-拉帕醌可通過降低BCL-2/Bax途徑誘導HepG2肝癌細胞凋亡。Jeon等[24]報道表明β-拉帕醌通過凋亡相關蛋白抑制NSCLC細胞增殖和誘導凋亡。本研究的結果與上述報道一致,Fadu細胞經β-拉帕醌處理后,Bcl-2蛋白表達下調,而Bax蛋白的表達上調(BCL-2/Bax比值明顯下降),提示β-拉帕醌可能通過凋亡相關蛋白途徑誘導下咽癌細胞凋亡的發(fā)生。

轉移是任何類型癌癥死亡的根本原因,而且由于轉移過程的復雜性,人們對癌癥生物學的這一方面仍然知之甚少[25]。目前,在腫瘤侵襲和轉移過程中,上皮細胞向間充質細胞的轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)被認為是一個關鍵的發(fā)展過程[26]。然而,關于EMT在β-拉帕醌抑制下咽癌細胞中的作用尚不清楚。因此,本實驗研究了β-拉帕醌和EMT相關分子標志物之間的關系,以闡明β-拉帕醌對下咽癌侵襲和轉移的分子機制。Western blot檢測結果顯示,經β-拉帕醌處理后的Fadu細胞中,與0 μmol/L相比,E-cadherin蛋白的表達水平升高,vimentin和Snail蛋白的表達水平降低,呈現(xiàn)EMT典型的相關分子標志物的表現(xiàn)。這些實驗結果表明,β-拉帕醌可以顯著抑制Fadu細胞的EMT進展。

綜上所述,β-拉帕醌作為NQO1的有效抑制劑可顯著抑制下咽癌細胞的增殖、誘導下咽癌細胞凋亡,還可通過EMT途徑體外抑制下咽癌細胞的遷移能力。本研究為β-拉帕醌的開發(fā)及下咽癌的治療提供了參考價值,可以預見β-拉帕醌有望成為新的靶向治療藥應用于下咽癌臨床治療。但詳細確切的機制還有待于進一步的實驗證明。