唐 迪,左其明,張 佼,李 鋒,彭善君,王田輝

(1重慶市梁平區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科,重慶 405200;2重慶市奉節(jié)縣人民醫(yī)院泌尿外科;*通訊作者,E-mail:wangtianhuifengjie@163.com)

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅男性居民健康[1]。前列腺癌的發(fā)病率逐年增加,呈年輕化趨勢(shì),前列腺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為造成部分前列腺癌患者的生存率很低[2]。深入研究前列腺癌細(xì)胞侵襲和增殖的作用機(jī)制,對(duì)了解前列腺癌發(fā)生、發(fā)展及確定新的分子治療靶點(diǎn)具有重要臨床意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA,lncRNA)長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸,主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核,屬于非編碼RNA,在細(xì)胞發(fā)育、新陳代謝等各項(xiàng)生命活動(dòng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用[3]。越來(lái)越多的研究表明,lncRNA可在表觀遺傳學(xué)水平影響腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá),參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為[4]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),lncRNA在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮抑癌基因或癌基因的作用[5]。研究前列腺癌相關(guān)lncRNA,有望明確前列腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的病理、生理機(jī)制。RP11-374M1.2是一個(gè)尚未被報(bào)道研究的lncRNA,長(zhǎng)度為1 407 nt。本研究檢測(cè)了37例前列腺癌手術(shù)患者的腫瘤組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織中RP11-374M1.2的表達(dá),通過(guò)在前列腺癌DU-145細(xì)胞中過(guò)表達(dá)RP11-374M1.2,觀察RP11-374M1.2對(duì)前列腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響,并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 組織樣本來(lái)源

收集重慶市梁平區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科自2017年5月至2019年3月手術(shù)切除的組織標(biāo)本37例,液氮中保存。所有前列腺癌組織和癌旁組織均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí),前列腺癌組織學(xué)類(lèi)型均為腺癌。所有患者術(shù)前均未接受放射治療、化學(xué)治療和抗雄激素藥物治療。本研究經(jīng)重慶市梁平區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 細(xì)胞株和主要試劑

DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司;前列腺癌細(xì)胞株DU-145購(gòu)于上海信然生物技術(shù)有限公司;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;陰性對(duì)照慢病毒、攜帶RP11-374M1.2的慢病毒購(gòu)于南京諾唯贊生物科技有限公司;胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)試劑盒購(gòu)于日本TaKaRa公司;Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Corning公司;一抗ZEB-1、LKB1、GAPDH、CDK4、Snail及Cyclin D2購(gòu)于美國(guó)Abcam公司;基質(zhì)膠購(gòu)于美國(guó)Life Technologies公司;超敏ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和感染

前列腺癌細(xì)胞株DU-145采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將活力良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期DU-145細(xì)胞種板,細(xì)胞匯合度為60%時(shí)感染慢病毒。設(shè)置感染復(fù)數(shù)為30,實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作,分別感染攜帶RP11-374M1.2的慢病毒和陰性對(duì)照慢病毒,定義為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。慢病毒感染12 h后,更換新鮮培養(yǎng)基。

1.4 qPCR檢測(cè)RP11-374M1.2和LKB1 mRNA的表達(dá)量

取150 mg組織或相應(yīng)各組細(xì)胞,根據(jù)說(shuō)明書(shū)采用Trizol試劑提取總RNA,紫外分光儀檢測(cè)RNA濃度和純度后,逆轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA。qPCR法檢測(cè)RP11-374M1.2和LKB1 mRNA的相對(duì)表達(dá)。以GAPDH作內(nèi)參,計(jì)算RP11-374M1.2和LKB1的表達(dá)量,所得數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法計(jì)算。引物序列見(jiàn)表1。qPCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性60 s,95 ℃變性15 s,62 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,共35個(gè)循環(huán)。

表1 qPCR引物序列

1.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)感染DU-145細(xì)胞的侵襲能力

將基質(zhì)膠均勻鋪在Transwell上室,凝固1 h。收集感染后48 h的DU-145細(xì)胞,應(yīng)用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為4×105個(gè)/ml。加入200 μl細(xì)胞懸液至上室,加入700 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基至下室。24 h后,采用多聚甲醛固定20 min,采用結(jié)晶紫染液染色20 min,采用流水沖洗殘余染液,采用棉簽輕輕擦去未穿膜細(xì)胞。室溫晾干,高倍顯微鏡下統(tǒng)計(jì)每組穿過(guò)底膜的細(xì)胞數(shù),表示DU-145細(xì)胞的侵襲能力。

1.6 四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)感染DU-145細(xì)胞的增殖能力

收集感染后48 h的DU-145細(xì)胞,應(yīng)用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度,以每孔3 000個(gè)接種于96孔板,每組4個(gè)復(fù)孔。分別于接種細(xì)胞后的第1-5天行MTT檢測(cè),每孔加入18 μl MTT試劑,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,每孔加入180 μl二甲基亞砜,振蕩溶解結(jié)晶。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔在波長(zhǎng)495 nm處的吸光度(A)值。

1.7 Western blot檢測(cè)靶基因的表達(dá)

收集感染后48 h的DU-145細(xì)胞,采用蛋白提取緩沖液提取細(xì)胞總蛋白。每組的蛋白上樣量均為60 μg。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,采用PVDF膜轉(zhuǎn)膜,采用5%脫脂牛奶在室溫下封閉PVDF膜。分別孵育LKB1(稀釋比為1 ∶1 000)、CDK4(稀釋比為1 ∶3 000)、Cyclin D2(稀釋比為1 ∶2 000)、Snail(稀釋比為1 ∶1 000)、ZEB-1(稀釋比為1 ∶1 000)和GAPDH一抗(稀釋比均為1 ∶2 000),在4 ℃搖床孵育過(guò)夜。洗膜后,在室溫下孵育二抗鼠抗(稀釋比為1 ∶10 000)。配制超敏ECL發(fā)光試劑,在凝膠成像儀中顯影、拍照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌組織中RP11-374M1.2的表達(dá)

qPCR結(jié)果顯示,37例前列腺癌組織和癌旁組織中RP11-374M1.2的相對(duì)表達(dá)量分別為0.84±0.23和5.71±1.43,癌旁組織RP11-374M1.2的相對(duì)表達(dá)量是前列腺癌組織的4.08倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=23.93,P<0.01)。

2.2 DU-145細(xì)胞感染RP11-374M1.2病毒的效率

qPCR結(jié)果顯示,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中RP11-374M1.2的相對(duì)表達(dá)量分別為1.02±0.81和12.39±1.89,實(shí)驗(yàn)組RP11-374M1.2的相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照組的12.12倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.97,P<0.01)。

2.3 RP11-374M1.2對(duì)DU-145細(xì)胞侵襲能力的影響

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中穿膜DU-145細(xì)胞數(shù)分別為(93.15±10.05)個(gè)和(24.50±7.82)個(gè)。與對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組穿膜DU-145細(xì)胞數(shù)明顯較少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.19,P<0.01,見(jiàn)圖1),RP11-374M1.2具有抑制前列腺癌DU-145細(xì)胞侵襲的能力。

與對(duì)照組相比,**P<0.01圖1 RP11-374M1.2對(duì)DU-145細(xì)胞侵襲能力的影響Figure 1 Effect of RP11-374M1.2 on the invasion ability of DU-145 cells

2.4 RP11-374M1.2對(duì)DU-145細(xì)胞增殖能力的影響

MTT法結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組DU-145細(xì)胞在感染后第3,4,5天的A值低于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),表明RP11-374M1.2具有抑制前列腺癌DU-145細(xì)胞增殖的能力。在第1,2天的A值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.18,P>0.05;t=2.19,P>0.05,見(jiàn)圖2)。

與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01圖2 RP11-374M1.2對(duì)DU-145細(xì)胞增殖能力的影響Figure 2 Effect of RP11-374M1.2 on the proliferation of DU-145 cells

2.5 DU-145細(xì)胞感染RP11-374M1.2慢病毒對(duì)LKB1 mRNA表達(dá)的影響

qPCR結(jié)果顯示,感染RP11-374M1.2慢病毒后的實(shí)驗(yàn)組DU-145細(xì)胞中LKB1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(7.37±2.14vs1.06±0.05,t=12.52,P<0.01,見(jiàn)圖3),表明RP11-374M1.2可有效促進(jìn)LKB1 mRNA的相對(duì)表達(dá)。

與對(duì)照組比較,**P<0.01圖3 RP11-374M1.2對(duì)LKB1 mRNA表達(dá)的影響Figure 3 Effect of RP11-374M1.2 on the expresstion of LKB1 mRNA

2.6 LKB1蛋白的表達(dá)水平

Western blot結(jié)果表明,感染RP11-374M1.2慢病毒后的實(shí)驗(yàn)組DU-145細(xì)胞中,LKB1蛋白表達(dá)量明顯升高,細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白Snail蛋白和ZEB-1蛋白表達(dá)明顯減少,細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Cyclin D2蛋白和CDK4蛋白表達(dá)減少(見(jiàn)圖4)。

圖4 RP11-374M1.2對(duì)LKB1蛋白及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 4 Effect of RP11-374M1.2 on the expression of LKB1 protein and related proteins

3 討論

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA,lncRNA)是繼微小RNA后,非編碼RNA領(lǐng)域的又一熱點(diǎn)[6]。由于lncRNA不具備翻譯蛋白的功能,起初被人們認(rèn)為是“轉(zhuǎn)錄噪音”,不影響細(xì)胞的生命活動(dòng)[7]。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn),lncRNA可在表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平等多水平影響基因的表達(dá),具有明顯的生物學(xué)功能[8]。隨著研究深入,大量lncRNA被證實(shí)在包括前列腺癌在內(nèi)的惡性腫瘤中異常表達(dá),在腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化、進(jìn)展等過(guò)程起重要作用[9]。Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA MYU在前列腺癌組織中明顯上調(diào),可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移,lncRNA MYU主要通過(guò)miR-184/c-Myc分子軸發(fā)揮作用,在前列腺癌中起著類(lèi)似癌基因的作用。Zhao等[11]發(fā)現(xiàn)lncRNA ANRIL在前列腺癌組織和細(xì)胞株中高表達(dá),其主要通過(guò)調(diào)節(jié)let-7a/TGF-β1/Smad信號(hào)通路,促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。Huang等[12]發(fā)現(xiàn)lncRNA TMPO-AS1與前列腺癌的進(jìn)展和患者的不良預(yù)后密切相關(guān),通過(guò)影響細(xì)胞周期促進(jìn)細(xì)胞的增殖,并對(duì)前列腺癌細(xì)胞的遷移具有正向調(diào)控作用。lncRNA對(duì)于發(fā)現(xiàn)新的前列腺癌分子治療靶點(diǎn)具有重要意義。RP11-374M1.2是一種尚未被報(bào)道研究的lncRNA,其在前列腺癌組織中的表達(dá)和作用機(jī)制尚不清楚。

本研究以RP11-374M1.2作為研究對(duì)象,通過(guò)qPCR法驗(yàn)證其在37例配對(duì)組織中的表達(dá)差異,結(jié)果顯示,與癌旁組織相比,RP11-374M1.2在前列腺癌組織中的表達(dá)明顯降低,RP11-374M1.2可能具有抑制前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的作用。通過(guò)進(jìn)一步研究RP11-374M1.2對(duì)前列腺癌侵襲和增殖的影響,將載有RP11-374M1.2的慢病毒感染前列腺癌DU-145細(xì)胞,通過(guò)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和MTT法檢測(cè)上調(diào)RP11-374M1.2后DU-145細(xì)胞的侵襲和增殖能力。結(jié)果顯示,上調(diào)RP11-374M1.2可明顯抑制前列腺癌DU-145細(xì)胞的侵襲能力和增殖能力,表明RP11-374M1.2可抑制前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)。

肝激酶B1(LKB1)基因位于第19號(hào)染色體短臂13.3區(qū),由10個(gè)外顯子組成,可翻譯為433個(gè)氨基酸組成的細(xì)胞內(nèi)激酶[13]。LKB1幾乎表達(dá)于人體所有組織,負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞增殖、新陳代謝等各種生理活動(dòng)[14]。近年的研究發(fā)現(xiàn),LKB1在多種惡性腫瘤如肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌表達(dá)缺失或突變,導(dǎo)致細(xì)胞不可控性侵襲和增殖,參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸[15]。研究發(fā)現(xiàn),LKB1在前列腺癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)明顯降低,在DU-145細(xì)胞株中的表達(dá)最低,與多西他賽的化療敏感性顯著相關(guān)[16,17]。上調(diào)LKB1可明顯抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,LKB1在前列腺癌中發(fā)揮抑癌基因作用[18]。qPCR和Western blot顯示,上調(diào)RP11-374M1.2在mRNA和蛋白水平上均可明顯促進(jìn)LKB1基因的表達(dá)。LKB1蛋白表達(dá)升高后,細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白Snail和ZEB-1蛋白表達(dá)明顯降低,細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Cyclin D2和CDK4蛋白表達(dá)明顯降低,表明細(xì)胞侵襲能力和增殖能力受到明顯抑制。RP11-374M1.2是通過(guò)降低LKB1基因的表達(dá),參與抑制前列腺癌細(xì)胞的侵襲和增殖能力。

綜上所述,前列腺癌組織中RP11-374M1.2呈低表達(dá),上調(diào)RP11-374M1.2明顯抑制前列腺癌細(xì)胞的侵襲和增殖能力,其作用機(jī)制可能通過(guò)上調(diào)LKB1基因的表達(dá)。RP11-374M1.2在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中起著類(lèi)似抑癌基因的作用,有望在未來(lái)成為前列腺癌分子治療新的靶點(diǎn)。