丁曉嬌,章海斌,趙 報,殷文博,陳 瑩,王子安*

(1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,蚌埠 233000;2蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科;*通訊作者,E-mail:wangzian118@sina.com)

胃癌(gastric cancer,GC)是常見的消化道惡性腫瘤之一,全球腫瘤發(fā)病率中位居第六,死亡率位居第四[1]。目前胃癌治療方式主要包括手術(shù)輔助化療以及靶向治療等,然而晚期胃癌患者總體預(yù)后仍舊較差,術(shù)后5年生存率不足30%[2],這與腫瘤的易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移特性密不可分。因此,尋找新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)對胃癌的治療具有重要意義。

微小RNA(microRNAs,miRNA)是一類內(nèi)源性、進(jìn)化保守的非編碼RNA,通過與靶RNA的3′-UTR結(jié)合,導(dǎo)致靶mRNA的降解及其翻譯抑制,調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種基本生理過程如細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3-5]。多項(xiàng)研究證明,miR-10a-5p在膽管癌[6]、乳腺癌[7]、宮頸癌[8]等多種腫瘤中表達(dá)異常,參與調(diào)控其惡性生物學(xué)行為。然而,對于miR-10a-5p在胃癌侵襲遷移中的作用及其分子機(jī)制,研究仍舊較少。維甲酸受體相關(guān)孤兒受體A(RAR-related orphan receptor A,RORA)基因在人類染色體定位于15q22.2,是孤兒受體ROR子家族的成員之一。研究表明,RORA在肺癌[9]、肝癌[10]、卵巢癌[11]、皮膚黑色素瘤[12]等多腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。本研究旨在探討miR-10a-5p在胃癌的侵襲遷移中扮演的角色,為胃癌臨床治療尋找新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑

正常人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1、人胃癌細(xì)胞株(AGS、SGC-7901、BGC-823)購自IBS細(xì)胞資源中心;RPMI-1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司;胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司;BCA蛋白定量試劑盒及蛋白印跡(Western blot)試劑盒、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素雙抗均購自碧云天生物技術(shù)公司;miR-10a-5p inhibitor、NC、RORA過表達(dá)序列均購自上海吉瑪基因有限公司;轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?2000購自ThermoScientific公司;一抗(β-actin、RORA、E-cadherin、N-cadherin、Snail)及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔/鼠二抗均購于武漢三鷹生物技術(shù)公司;ECL顯影液購于Abbkine公司;GAPDH引物、U6引物、miR-10a-5p、RORA引物均購自上海生工生物工程股份有限公司;Trizol、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo Scientific有限公司;TB Green TM Primix Ex Taq TM試劑盒購自日本TaKaRa公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自Biofroxx公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

正常人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1、人胃癌細(xì)胞株(AGS、SGC-7901、BGC-823)培養(yǎng)于含100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中,在37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況,48 h更換培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到90%時,0.25%胰酶消化后傳代,取傳3代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取傳3代的SGC-7901細(xì)胞,胰酶消化后計數(shù),細(xì)胞鋪板,待細(xì)胞融合50%-80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行。為了探討miR-10a-5p是否通過靶向RORA對胃癌細(xì)胞侵襲、遷移產(chǎn)生影響及其機(jī)制,將SGC-7901細(xì)胞分為control組(只轉(zhuǎn)染Lipofectamine?2000)、NC組(轉(zhuǎn)染Lipofectamine?2000及NC序列,序列5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′)和miR-10a-5p inhibitor組(Lipofectamine?2000及miR-10a-5p inhibitor,序列5′-CACAAA-UUCGGAUCUACAGGGUA-3′)。通過qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染miR-10a-5p inhibitor后miR-10a-5p及RORA的相對表達(dá)水平;通過克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測miR-10a-5p inhibitor對細(xì)胞增殖能力的影響;Western blot檢測β-actin、RORA、E-cadherin、N-cadherin、Snail蛋白的表達(dá);miR-10a-5p對細(xì)胞侵襲和遷移的影響由Transwell實(shí)驗(yàn)檢測。同時對SGC-7901轉(zhuǎn)染RORA過表達(dá)序列,方法如上,實(shí)驗(yàn)分為control組(只轉(zhuǎn)染Lipofectamine?2000)、NC組(轉(zhuǎn)染Lipofectamine?2000及NC序列)和RORA過表達(dá)組(轉(zhuǎn)染Lipofectamine?2000及RORA過表達(dá)序列)。通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢測RORA對細(xì)胞侵襲和遷移的影響。

1.3 實(shí)時熒光定量PCR檢測miR-10a-5p及RORA相對表達(dá)

0.25%胰酶消化收集實(shí)驗(yàn)組及對照組細(xì)胞,用Trizol提取細(xì)胞內(nèi)總RNA,將提取的RNA用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA,合成的cDNA用TB GREEN試劑盒通過PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以U6為內(nèi)參檢測miR-10a-5p在正常胃黏膜細(xì)胞GES-1及GC細(xì)胞株AGS、SGC-7901、BGC-823中的表達(dá)水平。分別以U6與GAPDH為內(nèi)參檢測miR-10a-5p及RORA相對表達(dá)量,最終Ct值采用2-ΔΔCt進(jìn)行分析,引物序列見表1。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列

實(shí)時熒光定量PCR采用兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序。stage 1:預(yù)變性(95 ℃,30 s),Stage 2:PCR反應(yīng)(95 ℃,5 s;60 ℃,30 s),共40個循環(huán),采用2-ΔΔCt法計算miR-10a-5p相對表達(dá)量,所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.4 Western blot檢測β-actin、RORA、E-cadherin、N-cadherin、Snail蛋白的表達(dá)

0.25%胰酶消化收集SGC-7901細(xì)胞,分別加入適量RIPA細(xì)胞裂解液(含0.1%蛋白酶抑制劑),置于冰上裂解30 min,將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中,-20 ℃冰箱過夜,次日4 ℃、12 000 r/min離心30 min,收集上清液,BCA法進(jìn)行蛋白定量。分別取50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE,恒壓100 V 70 min,冰浴轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上;快速封閉液封閉15 min;加入按1 ∶1 000稀釋的一抗(β-actin、RORA、E-cadherin、N-cadherin、Snail),4 ℃搖床孵育過夜;次日,TBST洗膜3次,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔/鼠二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h;TBST洗滌3次,ECL化學(xué)發(fā)光顯像。以β-actin為內(nèi)參,采用Image J圖像分析軟件計算目的蛋白相對表達(dá)量。

1.5 靶基因檢測及驗(yàn)證

根據(jù)生物信息學(xué)軟件Target Scan預(yù)測miR-10a-5p和RORA 3′ UTR存在結(jié)合位點(diǎn),提示RORA可能是miR-10a-5p的直接靶基因。為證實(shí)該推測,研究通過qRT-PCR及Western blot分別檢測RORA mRNA及蛋白表達(dá)水平,實(shí)驗(yàn)分組及方法如1.2-1.4。

1.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測增殖能力

收集轉(zhuǎn)染后control組、NC組、轉(zhuǎn)染miR-10a-5p inhibitor組細(xì)胞,胰酶消化后用RPMI-1640培養(yǎng)基重懸,以1 000個/孔密度接種于6孔板中,37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周。棄去培養(yǎng)基,用PBS洗滌2遍,加入4%多聚甲醛,-20 ℃固定10 min,結(jié)晶紫染色,靜置20 min,使用4 ℃預(yù)冷的雙蒸水洗滌,室溫下晾干,拍照并記錄結(jié)果。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測miR-10a-5p對細(xì)胞侵襲和遷移的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)用來分別檢測miR-10a-5p對胃癌細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響。檢測侵襲能力時,將Materigel膠與Opti按1 ∶8的比例稀釋,每孔加入60 μl的Materigel膠均勻覆蓋Transwell小室底部,培養(yǎng)60 min。取轉(zhuǎn)染后control組、NC組、轉(zhuǎn)染miR-10a-5p inhibitor組細(xì)胞,胰酶消化后用無血清1640培養(yǎng)基重懸,調(diào)整至5×104個/孔密度加入到Transwell小室上室中,下室加入600 μl含10% FBS的1640培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)48 h。用潤濕的棉簽小心擦去小室上層細(xì)胞并用雙蒸水洗滌,在24孔板中每孔加入600 μl的4%多聚甲醛固定15 min,結(jié)晶紫染色20 min,雙蒸水洗滌后室溫晾干,100倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野拍照記錄,Image J軟件進(jìn)行計數(shù),細(xì)胞數(shù)取平均值。遷移實(shí)驗(yàn)不鋪膠,其余操作同侵襲實(shí)驗(yàn)相同。

1.8 轉(zhuǎn)染RORA過表達(dá)序列對細(xì)胞侵襲和遷移的影響

為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-10a-5p靶向調(diào)控RORA的表達(dá)是否影響SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲和遷移,本研究設(shè)RORA OE轉(zhuǎn)染組control組(只轉(zhuǎn)染Lipofectamine?2000)、RORA NC轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染Lipofectamine?2000及NC序列)、RORA過表達(dá)組(Lipofectamine?2000及RORA過表達(dá)序列)。轉(zhuǎn)染48 h采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測RORA對SGC-7901細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響,方法同1.7。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次,采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較則采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-10a-5p在GC細(xì)胞中的表達(dá)

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,與正常人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1相比,miR-10a-5p在不同GC細(xì)胞(AGS、SGC-7901、BGC-823)中的表達(dá)量有不同程度的升高,其中在SGC-7901細(xì)胞中表達(dá)量最高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖1),故選擇該細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

與GES-1細(xì)胞相比,*P<0.05圖1 miR-10a-5p在不同胃癌細(xì)胞株中表達(dá)量的比較Figure 1 Expression of miR-10a-5p in different gastric cancer cell lines

2.2 轉(zhuǎn)染miR-10a-5p inhibitor對SGC-7901細(xì)胞中miR-10a-5p表達(dá)的影響

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,miR-10a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染組SGC7901細(xì)胞中miR-10a-5p的表達(dá)量顯著低于control組和NC組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖2)。

與control組及NC組比較,*P<0.05圖2 轉(zhuǎn)染miR-10a-5p inhibitor對SGC-7901細(xì)胞中miR-10a-5p表達(dá)的影響Figure 2 Effect of miR-10a-5p inhibitor on miR-10a-5p expression in SGC-7901 cells

2.3 miR-10a-5p靶向調(diào)控RORA

生物信息學(xué)軟件Target Scan預(yù)測結(jié)果顯示,RORA 3′UTR上存在潛在的與miR-10a-5p靶向結(jié)合的位點(diǎn)(見圖3A),說明RORA可能是miR-10a-5p的靶基因。qRT-PCR結(jié)果顯示,在胃癌細(xì)胞SGC-7901中RORA mRNA表達(dá)水平miR-10a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染組相較于control及NC組升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖3B)。Western blot結(jié)果顯示,相較于control及NC組,miR-10a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染組SGC-7901細(xì)胞中RORA蛋白表達(dá)水平升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖3C)。

與control組及NC組相比,*P<0.05圖3 RORA是mir-10a-5p的靶基因Figure 3 RORA is the target gene of mir-10a-5p

2.4 轉(zhuǎn)染miR-10a-5p inhibitor對SGC-7901細(xì)胞遷移能力的影響

為了解下調(diào)miR-10a-5p對SGC-7901細(xì)胞侵襲遷移能力的影響,實(shí)驗(yàn)分為control組、NC組、miR-10a-5p inhibitor組,Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染48 h時miR-10a-5p inhibitor組穿膜細(xì)胞數(shù)目顯著低于control組和NC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖4)。結(jié)果表明,下調(diào)miR-10a-5p能抑制SGC-7901細(xì)胞侵襲、遷移能力。

與control組及NC組比較,*P<0.05圖4 miR-10a-5p對胃癌細(xì)胞SGC-7901侵襲、遷移能力的影響 (×100)Figure 4 The effect of miR-10a-5p on invasion and migration abilities of gastric cancer cell line SGC-7901 (×100)

2.5 轉(zhuǎn)染miR-10a-5p inhibitor對SGC-7901細(xì)胞增殖的影響

集落克隆結(jié)果顯示,相對于control組及NC組,miR-10a-5p inhibitor組集落形成數(shù)目下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖5),證明下調(diào)miR-10a-5p可抑制SGC-7901細(xì)胞增殖能力。

與control組及NC組比較,*P<0.05圖5 miR-10a-5p對胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖能力的影響Figure 5 The effect of miR-10a-5p on the proliferation ability of gastric cancer cell SGC-7901

2.6 過表達(dá)RORA對SGC-7901侵襲、遷移能力的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過表達(dá)RORA后48 h RORA過表達(dá)組穿膜細(xì)胞數(shù)少于control組和NC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖6)。結(jié)果提示,過表達(dá)RORA能夠顯著抑制SGC-7901細(xì)胞侵襲、遷移能力。

與control組及NC組比較,*P<0.05圖6 過表達(dá)RORA對胃癌細(xì)胞SGC-7901侵襲遷移能力的影響 (×100)Figure 6 Effect of overexpressing RORA on invasion and migration of gastric cancer cell line SGC-7901 (×100)

2.7 下調(diào)miR-10a-5p對SGC-7901細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin、Snail蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示,miR-10a-5p inhibitor組N-cadherin、Snail的蛋白表達(dá)低于control和NC組。相反,E-cadherin在miR-10a-5p inhibitor組中的表達(dá)高于control和NC組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖7)。

3 討論

目前,胃癌治療仍舊首選以手術(shù)為主的綜合治療,然而其死亡率仍舊較高,這與胃癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移有著密不可分的關(guān)系[13]。因此,尋找胃癌治療的新靶點(diǎn),進(jìn)而減少或者抑制侵襲與轉(zhuǎn)移是改善胃癌患者預(yù)后,提升患者生存率的重要條件。

近年來研究發(fā)現(xiàn)同時靶向關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因和異常表達(dá)的miRNA可能是預(yù)防惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的有效策略,因此miRNA可充當(dāng)一種有效的分子靶向藥物對腫瘤進(jìn)行治療[14]。據(jù)報道,miR-10a-5p在多種癌癥的發(fā)生進(jìn)展中起著重要的作用。有研究證明miR-10a-5p在胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)中過表達(dá)并作為轉(zhuǎn)移形成的重要介質(zhì)[15]。Yu等[16]發(fā)現(xiàn)miR-10a-5p在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中呈過表達(dá)并靶向PTEN促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲和遷移。Gao等[17]提出抑制miR-10a-5p可通過下調(diào)Akt途徑抑制膽管癌細(xì)胞的生長,而miR-10a-5p在胃癌中的表達(dá)及作用有待研究。

與control組及NC組比較,*P<0.05圖7 SGC-7901細(xì)胞下調(diào)miR-10a-5p對EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin、Snail蛋白表達(dá)的影響Figure 7 Effect of down-regulating miR-10a-5p on the expression of EMT-related proteins E-cadherin, N-cadherin and Snail in SGC-7901 cells

本實(shí)驗(yàn)通過qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,與正常人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1相比,miR-10a-5p在不同GC細(xì)胞中的表達(dá)量顯著上調(diào)。研究證明,miRNA參與腫瘤生物學(xué)行為取決于其下游靶點(diǎn)[18]。通過生物信息學(xué)軟件Target Scan預(yù)測RORA可能為miR-10a-5p的潛在靶基因。后續(xù)通過qRT-PCR及Western blot驗(yàn)證結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-10a-5p inhibitor可在蛋白水平及mRNA水平負(fù)向調(diào)控RORA。本研究集落克隆和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,下調(diào)SGC-7901細(xì)胞中的miR-10a-5p能夠顯著抑制SGC-7901細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲。然而其作用機(jī)制尚不清晰。同時,本研究在SGC-7901中過表達(dá)RORA發(fā)現(xiàn),過表達(dá)RORA可抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的侵襲與遷移能力。因此,我們認(rèn)為miR-10a-5p能夠靶向RORA調(diào)控SGC-7901侵襲、遷移。RORA是孤兒受體ROR子家族的成員,在各種生物過程中(包括小腦發(fā)育,細(xì)胞增殖和晝夜節(jié)律控制)以及自身免疫、肥胖、腫瘤中充當(dāng)核受體轉(zhuǎn)錄因子[19-21]。RORA已被報告在人胃癌組織與胃癌細(xì)胞系中低表達(dá),而且RORA的減少與腫瘤進(jìn)展和胃癌預(yù)后不良有關(guān)[22]。研究證明,在膠質(zhì)瘤中RORA是miR-10a的靶基因,并通過激活NF-κB通路進(jìn)一步增強(qiáng)髓系來源的抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSC)活性[23]。

EMT(epithelial-mesenchymal transition,EMT)指上皮細(xì)胞特性逐漸消失,而逐漸表現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞特性的過程。研究證明,EMT與癌細(xì)胞的高侵襲性和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[24]。越來越多的證據(jù)表明miRNAs通過調(diào)節(jié)EMT過程,在某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,發(fā)揮促癌基因或抑癌基因的作用,參與侵襲和轉(zhuǎn)移過程[25-27]。為了確定下調(diào)miR-10a-5p抑制SGC-7901細(xì)胞侵襲和遷移的機(jī)制,本研究采用Western blot法檢測下調(diào)miR-10a-5p后與EMT相關(guān)的蛋白E-cadherin、N-cadherin和Snail的表達(dá),結(jié)果顯示,E-cadherin表達(dá)顯著升高,而N-cadherin、Snail表達(dá)顯著降低,提示下調(diào)miR-10a-5p可通過EMT途徑抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述,下調(diào)miR-10a-5p可通過上調(diào)靶基因RORA表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力,其機(jī)制為通過EMT途徑促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移,所以miR-10a-5p可能是胃癌治療的潛在分子靶點(diǎn),因此在此基礎(chǔ)上探索新型核酸藥物的研發(fā),可能為胃癌的診斷和治療帶來積極的意義。