措 羊,張雙元

(1青海省交通醫(yī)院普外科,西寧 810000;2青海大學附屬醫(yī)院腫瘤外科)

甲狀腺癌是一種內分泌系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,惡性程度較低,在女性中發(fā)病率較高,流行病學研究顯示,近30年來,其發(fā)病率一直呈上升趨勢[1]。甲狀腺癌的發(fā)病機制目前尚不明確,但隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展,其病因、發(fā)生發(fā)展等方面的研究也在不斷深入[2]。微小RNA(microRNA,miRNA)是在線蟲研究中發(fā)現的一種高度保守的非編碼小RNA分子,主要通過調控靶基因轉錄水平在生理、病理過程中發(fā)揮調控作用,是最近腫瘤研究領域的熱點[3,4]。有研究證實,多個miRNA在甲狀腺癌中表達異常,與甲狀腺癌臨床特征密切相關[5]。研究發(fā)現,miR-551b在胃癌組織中表達下降,能夠抑制胃癌細胞的增殖、侵襲等細胞生物學功能,發(fā)揮類似抑癌基因的作用[6,7]。但miR-551b在甲狀腺癌中的作用尚不清楚。本研究旨在探討miR-551b在甲狀腺癌中的表達及其對細胞增殖、凋亡的影響,以期為尋找甲狀腺癌治療的新靶點提供一定依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人甲狀腺癌細胞SW579(貨號:HZ-CC100702)購自美國ATCC細胞庫;胎牛血清(貨號:FBS500-S)購自澳大利亞AusGeneX公司;DMEM培養(yǎng)基(貨號:KL-P0032)購自德國merck/sigma公司;Lipofectamine 2000轉染試劑(貨號:11668019)購自美國Invitrogen公司;CCK-8試劑(貨號:CK-04)購自日本同仁化學研究所;Annexin Ⅴ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(貨號:S0185)購自哈爾濱新海基因檢測有限公司;miRNA逆轉錄試劑盒(貨號:QP013/QP014)購自美國GeneCopoeia;實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)試劑盒(貨號:K1002S)購自美國Promega公司;nonsense siRNA、miR-551b siRNA、negative control-miR-551b、hsa-miR-551b mimic序列和miR-551b、U6引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)抗體、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)抗體、細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)抗體、GAPDH抗體(貨號:ab18197、ab53154、ab226977、ab181602)購自Abcam公司;辣根過氧化物酶標記的羊抗兔(貨號:0295G-HRP)購自美國Santa公司;恒溫培養(yǎng)箱(型號:MIR-162-PC/MIR-262-PC)購自日本松下公司;熒光定量PCR儀(型號:ABI 7500)購自美國Applied Biosystems公司;流式細胞儀(型號:BD FACSCanto Ⅱ)購自美國BD公司;酶標儀(型號:MODEL550)、化學發(fā)光成像系統(tǒng)(型號:ChemiDocXRS)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 qRT-PCR法檢測miR-551b在甲狀腺癌中的表達情況 收集2017年10月至2019年10月本院獲得的28例甲狀腺癌組織及其癌旁正常組織標本,均經病理診斷確診,標本獲取均獲得患者知情同意,且均于化放療等治療前經手術切除獲得,保存于液氮中。所有手術標本的采集均取得本院倫理委員會批準。

使用TRIzol試劑提取組織中總RNA,經逆轉錄合成cDNA,參照qRT-PCR試劑盒說明配制反應體系,在熒光定量PCR儀上進行擴增,以2-ΔΔCt法表示miR-551b表達水平,Ct值為擴增產物的熒光信號達到臨界閾值時對應的循環(huán)數,內參基因為U6。反應程序:95 ℃預變性10 min;95 ℃變性10 s,55 ℃退火35 s,72 ℃延伸1 min,循環(huán)40次。miR-551b逆轉錄頸環(huán)引物:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTGAAA-3′。miR-551b上游引物:5′-CTGAGCGACCCATACTTGG-3′,下游引物:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;內參U6上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.2 SW579細胞培養(yǎng)及分組 將SW579細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中,在37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞融合率達到80%左右,用胰蛋白酶消化、傳代培養(yǎng)。

取對數期SW579細胞,以1×105個/ml、100 μl/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板,分為對照組、siRNA NC組、miR-551b siRNA組、mimic NC組和miR-551b mimic組,其中對照組SW579細胞不進行轉染,siRNA NC組、miR-551b siRNA組、mimic NC組和miR-551b mimic組SW579細胞使用Lipofectamine 2000轉染試劑分別轉染nonsense siRNA、miR-551b siRNA、negative control-miR-551b和hsa-miR-551b mimic,轉染后培養(yǎng)48 h,收集細胞,qRT-PCR法檢測各組SW579細胞中miR-551b表達情況。

1.2.3 CCK-8法檢測各組SW579細胞增殖情況 經相應處理后,將SW579細胞培養(yǎng)48 h,加入CCK-8試劑后繼續(xù)培養(yǎng)2 h,使用全自動酶標儀測定450 nm波長時各孔的吸光度(optical density,OD)值。

1.2.4 流式細胞儀檢測各組SW579細胞凋亡情況 經相應處理后,將SW579細胞培養(yǎng)48 h,收集細胞,胰蛋白酶消化、PBS洗滌后,使用400 μl 1×結合緩沖液將SW579細胞調整成1×106個/ml的細胞懸浮液,按照Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒操作說明書步驟,加入Annexin Ⅴ-FITC、PI各5 μl,避光孵育1 h,使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5 流式細胞儀檢測各組SW579細胞周期分布情況 經相應處理后,將SW579細胞培養(yǎng)48 h,收集細胞,PBS洗滌,用-20 ℃預冷的70%乙醇固定1 h,離心除去乙醇,PBS洗滌,用500 μl RNase/PI重懸細胞,避光染色20 min,使用流式細胞儀檢測細胞周期分布情況,統(tǒng)計G0/G1期、S期、G2/M期細胞的百分比。

1.2.6 蛋白印跡(Western blot)法檢測各組SW579細胞中PCNA、Bax、Cyclin D1蛋白表達情況 經相應處理后,將SW579細胞培養(yǎng)48 h,收集細胞,使用蛋白提取試劑盒提取各組細胞總蛋白,測定蛋白濃度并進行定量。SDS-PAGE電泳分離蛋白質,轉至PVDF膜上,用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h,分別加入PCNA抗體(1 ∶500)、Bax抗體(1 ∶500)、Cyclin D1抗體(1 ∶500)、GAPDH抗體(1 ∶500),4 ℃孵育過夜,TBST洗滌后加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1 ∶1 000),室溫孵育1 h,ECL顯色,凝膠成像分析儀采集圖像并分析條帶灰度,目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內參GAPDH灰度值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 miR-551b在甲狀腺癌組織及癌旁正常組織中的表達

miR-551b在甲狀腺癌組織及癌旁正常組織中的表達水平分別為0.73±0.09和1.02±0.14,甲狀腺癌組織中miR-551b表達水平較癌旁正常組織顯著降低(t=9.220,P<0.05)。

2.2 各組SW579細胞中miR-551b表達情況

對照組、siRNA NC組、mimic NC組間SW579細胞中miR-551b表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與siRNA NC組相比,miR-551b siRNA組SW579細胞中miR-551b表達水平顯著降低(P<0.05);與mimic NC組相比,miR-551b mimic組SW579細胞中miR-551b表達水平顯著升高(P<0.05,見表1)。

表1 各組SW579細胞中miR-551b表達水平比較

2.3 各組SW579細胞增殖情況

對照組、siRNA NC組、mimic NC組間SW579細胞OD值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與siRNA NC組相比,miR-551b siRNA組SW579細胞OD值顯著升高(P<0.05);與mimic NC組相比,miR-551b mimic組SW579細胞OD值顯著降低(P<0.05,見表2)。

表2 各組SW579細胞OD值比較

2.4 各組SW579細胞凋亡情況

對照組、siRNA NC組、mimic NC組間SW579細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與siRNA NC組相比,miR-551b siRNA組SW579細胞凋亡率顯著降低(P<0.05);與mimic NC組相比,miR-551b mimic組SW579細胞凋亡率顯著升高(P<0.05,見表3、圖1)。

表3 各組SW579細胞凋亡率比較

圖1 各組SW579細胞凋亡情況Figure 1 Apoptosis in each SW579 cells groups

2.5 各組SW579細胞周期分布情況

對照組、siRNA NC組、mimic NC組間G0/G1期、S期、G2/M期SW579細胞比例差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與siRNA NC組相比,miR-551b siRNA組G0/G1期SW579細胞比例顯著降低(P<0.05),S期、G2/M期SW579細胞比例顯著升高(P<0.05);與mimic NC組相比,miR-551b mimic組G0/G1期SW579細胞比例顯著升高(P<0.05),S期、G2/M期SW579細胞比例顯著降低(P<0.05,見圖2、表4)。

圖2 各組SW579細胞周期分布情況Figure 2 Cell cycle distribution of SW579 cells in each group

表4 各組SW579細胞周期分布情況比較

2.6 各組SW579細胞中PCNA、Bax、Cyclin D1蛋白表達情況

對照組、siRNA NC組、mimic NC組間SW579細胞中PCNA、Bax、Cyclin D1蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與siRNA NC組相比,miR-551b siRNA組SW579細胞中PCNA、Cyclin D1蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),Bax蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);與mimic NC組相比,miR-551b mimic組SW579細胞中PCNA、Cyclin D1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),Bax蛋白表達水平顯著升高(P<0.05,見圖3、表5)。

圖3 各組SW579細胞中PCNA、Bax、Cyclin D1蛋白表達情況Figure 3 Expression of PCNA,Bax, Cyclin D1 proteins in SW579 cells in each group

表5 各組SW579細胞中PCNA、Bax、Cyclin D1蛋白表達水平比較

3 討論

miRNA是由20-22個核苷酸組成的、不編碼蛋白質的小分子RNA,廣泛存在于動植物體內,通過與靶基因mRNA的3′UTR互補匹配,影響靶基因的轉錄水平,參與調控個體發(fā)育、細胞增殖、凋亡、分化等一系列重要的生理過程[8]。雖然miRNA分子小、數量少,但能調控大量基因的表達,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[9]。在甲狀腺癌研究中,已有大量miRNA被發(fā)現在甲狀腺癌中異常表達,參與甲狀腺癌增殖、凋亡、遷移、侵襲等過程[10,11]。

miR-551b作為一種miRNA,有研究發(fā)現其與胃癌發(fā)生發(fā)展密切相關[12]。溫馨等[13]研究表明,miR-551b-3p在胃癌組織中低表達,并且能夠抑制胃癌細胞系HGC-27的增殖、遷移和侵襲。王婭南等[7]研究表明,miR-551b能夠抑制胃癌細胞的增殖和侵襲等細胞生物學功能。除了胃癌,郭欣等[14]在胰腺癌研究中發(fā)現,miR-551b-3p在4種胰腺癌細胞中的相對表達量均低于正常胰腺導管上皮細胞,其在胰腺癌組織中的表達低于癌旁組織,且其表達與胰腺癌的分化程度、淋巴結轉移以及TNM分期相關。然而,miR-551b在不同腫瘤中發(fā)揮的作用亦不同,在胃癌中發(fā)揮抑癌基因作用,在其他癌癥中可能發(fā)揮促癌基因作用[15]。Wei等[16]研究表明,miR-551b可能通過抑制Foxo3和TRIM31這兩個重要的腫瘤抑制因子,促進卵巢癌細胞、卵巢癌干細胞的增殖、侵襲及化學耐藥性。Chaluvally-Raghavan等[17]研究表明,miR-551b-3p表達增加與高級別漿液性上皮性卵巢癌的預后惡化有關,其在體外和體內均有助于抵抗癌細胞的凋亡,增加癌細胞的存活和增殖,沉默其表達可抑制裸鼠卵巢癌腫瘤的生長。

本研究檢測miR-551b在甲狀腺癌組織與癌旁正常組織中的表達發(fā)現,miR-551b在甲狀腺癌組織較癌旁正常組織中表達顯著降低。體外細胞實驗研究發(fā)現,與siRNA NC組相比,miR-551b siRNA組SW579細胞OD值顯著升高,miR-551b表達水平、細胞凋亡率顯著降低;與mimic NC組相比,miR-551b mimic組SW579細胞OD值顯著降低,miR-551b表達水平、細胞凋亡率顯著升高,這表明miR-551b在甲狀腺癌中可能發(fā)揮抑癌基因作用,可以抑制SW579細胞增殖并誘導其凋亡。進一步研究發(fā)現,與siRNA NC組相比,miR-551b siRNA組G0/G1期SW579細胞比例顯著降低,S期、G2/M期SW579細胞比例顯著升高;與mimic NC組相比,miR-551b mimic組G0/G1期SW579細胞比例顯著升高,S期、G2/M期SW579細胞比例顯著降低,提示miR-551b可能通過抑制SW579細胞向S期、G2/M期進展,并將細胞周期阻滯于G0/G1期,從而發(fā)揮抑制SW579細胞增殖、促進細胞凋亡的作用。PCNA是增殖相關基因,在甲狀腺癌增殖過程中發(fā)揮作用[18]。Bax是Bcl-2家族中的促凋亡成員,參與調控甲狀腺癌細胞凋亡[19]。Cyclin D1參與細胞周期進展,進而參與細胞的增殖、凋亡過程[20]。本研究結果顯示,與siRNA NC組相比,miR-551b siRNA組SW579細胞中PCNA、Cyclin D1蛋白水平顯著升高,Bax蛋白水平顯著降低;與mimic NC組相比,miR-551b mimic組SW579細胞中PCNA、Cyclin D1蛋白水平顯著降低,Bax蛋白水平顯著升高,提示miR-551b可能通過影響PCNA、Bax、Cyclin D1等表達參與對SW579細胞增殖、凋亡、細胞周期進展的調控。

綜上所述,miR-551b在甲狀腺癌組織中表達下調,可能通過將細胞周期阻滯于G0/G1期,抑制SW579細胞增殖并誘導其凋亡,有望成為甲狀腺癌治療的新靶點。