李婷婷， 李夢媛， 王雅琪， 馬曉玲， 付雪艷

（1.寧夏醫(yī)科大學，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學中醫(yī)學院，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學藥學院，銀川 750004）

腦卒中（sotrke）亦稱中風或腦血管意外，是急性腦血液循環(huán)障礙性腦血管疾病的總稱，隨著我國人口向老齡化趨勢的發(fā)展，腦卒中的發(fā)病率逐年增加，是我國第一大致死原因[1]?，F代醫(yī)學認為，血腦屏障（BBC）是阻礙藥物進入腦內發(fā)揮治療腦部疾病的最大障礙，許多藥物由于不能透過血腦屏障而不能發(fā)揮其作用，并且目前國內外仍沒有確定的方法來解決這一問題，因此臨床對于腦卒中的治療亟待更好療效的藥物出現[2]。中醫(yī)對腦卒中的認識歷史悠久，有豐富的臨床經驗，現代醫(yī)藥學者在前人的基礎上，開展了系列實驗研究，在揭示腦卒中發(fā)病機制及闡明中藥的藥效物質的治療機制方面，取得了一定成果[3]。近期的研究進展顯示[4-5]，民族醫(yī)藥在臨床以及民間應用治療和預防腦部疾病方面療效顯著。在選方用藥方面，很注重對香藥的應用，方劑中芳香藥所占比例為80%以上[5-6]。香藥可憑借其芳香開竅作用，快速透過血腦屏障進入腦內，發(fā)揮其引藥上行作用，某些復方在腦卒中方面發(fā)揮著其本有的芳香開竅作用外，還具有神經保護劑的功效[7]。本實驗室在前期收集整理古籍記載治療腦卒中的方劑后發(fā)現，單味藥物胡椒、蓽茇等藥在治療腦卒中方劑中出現頻次較多，理論上講，這些單味藥能夠在對腦卒中的治療過程中起主要作用。本實驗篩選出以上出現頻次較多的單味藥組成核心藥對，對其能否透過血腦屏障進行進一步研究。本實驗采用水蒸氣蒸餾法對核心藥對進行提取，通過GC-MS對核心方劑中揮發(fā)油類成分，對SD大鼠灌胃給藥后取腦組織勻漿，可檢測出腦脊液中揮發(fā)油類成分，確定治療腦卒中核心方劑透過血腦屏障的揮發(fā)油類成分。

1 材料與儀器

1.1 試劑及藥物

胡椒、蓽茇均購自安徽泰源中藥飲片有限公司，經寧夏醫(yī)科大學藥學院張新慧教授鑒定并依據2015年版《中國藥典》檢測均為合格。乙醚（分析純、天津市北聯精細化學品開發(fā)有限公司）；水合氯醛；無水硫酸鈉；0.5%羧甲基纖維素鈉；氫氧化鈉（天津大茂公司）；氯仿（天津大茂公司）。

1.2 儀器

LD-100粉碎機（湖南省長沙市常宏制藥機械設備廠）；98-I-C型電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；揮發(fā)油提取器；冷凝管；圓底燒瓶；100 μL微量進樣器（上海高鴿工貿有限公司）；GCMS-QP2010氣相色譜-質譜聯用儀（色譜柱：Agilent DB-5MS）。

1.3 實驗動物

SD大鼠60只，全雄，質量 180～350 g，購于寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心，動物生產許可證編號：SYXY（寧）2006-0001。

2 實驗方法

2.1 樣品的制備

2.1.1 揮發(fā)油的提取 將胡椒、蓽茇以1∶1的比例粉碎，加8倍量蒸餾水，按《中國藥典》2015年版水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，至揮發(fā)油無增加為止，加入適量無水硫酸鈉干燥后得淡黃色油狀物，密閉低溫保存。

2.1.2 GC-MS揮發(fā)油樣品制備 取制備的揮發(fā)油0.1 mL溶解于1 mL正己烷溶液中，通過微孔濾膜過濾后備用。

2.1.3 生物樣品的制備 大鼠隨機分成 5組（空白組、陰性對照組、低劑量組、高劑量組、超高劑量組），每組 12只，低劑量組以1000 mg·kg-1的劑量灌胃給藥［以0.5%的CMC-Na為溶劑，制成溶液（每mL含0.1 g揮發(fā)油），即得，使用前震蕩均勻］，高劑量組以2000 mg·kg-1的劑量灌胃，超高劑量組以60000 mg·kg-1的劑量灌胃，空白組給同等體積的溶劑，陰性對照組給同等體積的蒸餾水，每日灌胃2次。

第5天灌服40 min后，用10%的水合氯醛麻醉大鼠（劑量：3 mL·kg-1）。剪開大鼠頸部被毛，剝離肌肉層，暴露出大鼠枕骨大孔位置，用微量進樣器抽取腦脊液，同組大鼠腦脊液合并，加乙醚200 μL分兩次萃取，用0.45 μm微孔濾膜濾過備用。

取出全腦，生理鹽水洗凈，將同組大鼠腦組織合并。加入15 mL生理鹽水勻漿，3600 r·min-1離心 20 min，取上清液 1 mL，加入 2 mol·L-1NaOH 50 μL 、氯仿 2mL 振搖，3600 r·min-1離心 20 min。取出氯仿層，揮干。加入 2 mL乙醚，用 0.45 μm微孔濾膜濾過備用。

2.2 GC-MS對揮發(fā)油成分的分析

色譜柱：Agilent DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：石英毛細管柱，起始溫度為100℃，以5℃·min-1速度升至150℃，再以5℃·min-1速度升至 220℃，保持 20 min；載氣：氦氣；柱流量：1.33 mL·min-1；分流比：不分流；進樣量：1 μL；進樣口溫度：250℃ ；離子源溫度：200℃；采集方式：全掃描；掃描范圍：m/z 35～500。得到其GC-MS離子流圖，利用 NIST色譜庫進行自動檢索鑒別其結構。

3 實驗結果

3.1 藥材的提取結果

胡椒、蓽茇核心藥對經水蒸氣蒸餾法提取后得0.20988 g揮發(fā)油，其性狀為淡黃色透明油狀液體，提取率為0.23%。

3.2 核心方劑中揮發(fā)油成分的分析

核心方劑揮發(fā)油按本文中2.2項下GC-MS條件進行分析，該條件下各成分可得到良好分離。利用NIST色譜庫進行自動檢索鑒別其結構，從核心方劑揮發(fā)油中共分離和鑒定出30個化合物。見圖 1和表 1。

3.3 生物樣品中揮發(fā)油成分的分析

分別將空白組、陰性對照組、低劑量、高劑量組、超高劑量組SD大鼠的腦脊液（圖2～6）、腦組織勻漿（圖7～11）樣品按本文中2.2項下GC-MS條件進行分析。通過計算機自動檢索，得到生物樣品中的化合物結構，陰性對照組和空白組的腦脊液和腦組織中均無揮發(fā)油成分被檢出。與上述核心方劑揮發(fā)油的總離子流圖相同保留時間的化學成分進行對照比較，在給藥SD大鼠腦脊液和腦組織中鑒定了其中的1種化合物，為棕櫚酸衍生物。

表1 核心方劑中揮發(fā)油類成分的定性鑒定結果

4 討論

近十幾年來，我國腦卒中死亡率有明顯上升的趨勢，腦卒中死亡在城市居民中已位居首位[1]。防治缺血性腦卒中的藥物研究是國際上的熱點。由于急性缺血性腦卒中嚴重危害著人類健康，幸存者往往留下后遺癥，影響患者生活質量，也增加家庭和社會負擔。為此，研究藥物防治極為重要[4]。

李娟等[8]認為，具有香味的藥物有較多揮發(fā)油成分，可憑借其芳香開竅作用，快速進入腦內，發(fā)揮其引藥上行作用。寧國安[5]在對治療腦卒中核心方劑的收集整理后，認為治療腦卒中的藥物有120種。收錄過程發(fā)現101首方劑中，單味藥物胡椒、蓽茇、撒法郎、沒藥等香藥在治療腦卒中方劑中出現的頻次較多。因此本實驗在上述單味藥中進行選擇，將出現頻次較高的藥物作為核心方劑的組成藥物進行試驗?，F代研究發(fā)現，芳香植物含有芳香的精油成分[9]，開竅藥氣味濃郁芳香，有開竅醒神的作用，如麝香、牛黃、冰片、蘇合香等。其中揮發(fā)性成分可通過多途徑、多靶點等實現開竅醒神的效應，這類藥物在治療心腦血管疾病應用中十分普遍，越來越受到廣大研究者的重視[10]。本實驗旨在測定藥物透過血腦屏障進入腦內可能發(fā)揮治療腦卒中作用的成分，依據上述理論，把治療腦卒中的核心方劑中藥對揮發(fā)油類成分作為主要測定對象。

本實驗生物樣品為SD大鼠全腦的組織勻漿液以及腦脊液。腦組織勻漿液含有大量的大血管及軟腦膜上的微血管，生理鹽水洗凈后，也不可避免地含有腦微循環(huán)液中的成分，檢測結果不能確定為透過的成分。而腦脊液為第三、第四腦室脈絡叢產生的無色透明液體，充滿在各腦室、蛛網膜下腔和脊髓中央管內，血液中的血漿蛋白、大分子物質等難以進入腦脊液[11]。而在腦脊液采集的操作過程中，由于需要暴露出大鼠枕骨大孔，易因操作不當而收集到血液雜質。由于上述原因，所取的樣品中會有血液殘留，血藥濃度將影響腦組織中藥物濃度的測定[12]，本文采集大鼠腦組織和腦脊液進行檢測，盡量避免微血管中揮發(fā)油成分的干擾，力求更準確地確定核心方劑中的揮發(fā)油類透過的化學成分。腦組織為實驗動物處死后采集的樣品，因而測得的藥物濃度不能完全真實反映活體動物特征。GC-MS將氣相色譜高效的在線分離能力與質譜高選擇性、高靈敏度的檢測能力相結合，是作為復雜體系分離分析的有效研究手段，并且是揮發(fā)油分離分析的首選方法[13]。最終本實驗在SD大鼠灌胃低劑量組、高劑量組、超高劑量組腦脊液和腦組織勻漿中檢測到揮發(fā)油類成分棕櫚酸衍生物。胡椒、蓽茇均為胡椒科植物，已有文獻[14]表明，胡椒屬植物中揮發(fā)油成分，具有抑制乙酰膽堿酯酶（AChE）活性，在治療阿爾茲海默癥疾病方面具有潛在用途。因此透過血腦屏障的棕櫚酸衍生物的藥理活性有待進一步深入研究。

本實驗根據治療腦卒中核心方劑“芳香開竅，引藥上行”的特點，用水蒸氣蒸餾法提取核心方劑中揮發(fā)油類成分，SD大鼠灌胃給藥，運用藥理學相關知識，結合GC-MS定性分析其透過血腦屏障的揮發(fā)油類成分，初步證明了棕櫚酸TMS衍生物可透過SD大鼠血腦屏障進入腦組織，可能為治療腦卒中的有效成分?，F代研究表明棕櫚酸對骨髓間充質干細胞增殖、體外遷移及成骨、成軟骨分化具有積極促進作用[15]。許韜等[16]在小黃魚內臟油的提取及其棕櫚酸甘油酯低溫結晶富集工藝的研究中指出，魚油有預防心血管疾病、降低血脂、減少動脈粥樣硬化發(fā)生等作用，而其含有大量的棕櫚酸及其衍生物。棕櫚酸作為一種長鏈飽和脂肪酸，是血脂重要組成成分，主要用于腦血栓、腦動脈硬化、冠狀動脈硬化等病癥，推測其可能與核心方劑治療腦卒中的作用有關。