王 丹 ， 田春艷 ， 陳桂生 ， 亓 琪 ， 李海洋 ， 田彩紅

（1.寧夏醫(yī)科大學臨床學院，銀川 750004； 2.寧夏顱腦疾病重點實驗室，銀川 750004； 3.寧夏銀川市第三人民醫(yī)院，銀川 7500044； 4.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，銀川 750004）

全國第三次死因回顧抽樣調(diào)查報告指出，腦卒中是我國目前第一死亡及成年人首位致殘的原因，同時是全球第二大致死因素、第一大致殘因素[1－2]，缺血性腦卒中占腦卒中的 70%～80%，是嚴重危害人類健康的疾患。缺血性腦血管疾病的研究方法多種多樣，利用動物模型比較接近于疾病的病理狀態(tài)，但由于動物實驗周期長、樣品量大、花費高、個體差異大，動物模型的制備具有一定難度，從而限制了其應用[3-5]，由于原代培養(yǎng)海馬細胞污染率高，建立缺氧/復氧模型存在一定困難，因此小鼠海馬神經(jīng)元細胞（HT22細胞）成為體外細胞實驗的良好選擇。而體外實驗采用細胞培養(yǎng)，利用化學或物理干預措施模擬人體缺血缺氧狀態(tài)更為便捷，因此細胞缺氧/復氧損傷模型被廣泛地應用于神經(jīng)細胞缺血缺氧損傷的研究[6]。目前公認細胞缺氧合并培養(yǎng)基缺糖能造成體內(nèi)缺血模型[7]，連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）是一種氧清除劑，可有效清除細胞培養(yǎng)基質(zhì)中的氧，且并不會損傷細胞膜[8-9]，且有研究報道[10]，2 mmol·L-1Na2S2O4溶液可保持無氧狀態(tài)1 h左右，溶液的pH值并無變化，但利用Na2S2O4建立HT22細胞缺氧/復氧模型的文章鮮見報道。因此，本研究應用Na2S2O4建立HT22細胞的缺氧/復氧模型，以HT22細胞形態(tài)變化和損傷情況為指標，以期建立一種穩(wěn)定的HT22細胞擬缺氧性損傷模型。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

HT22細胞（寧夏顱腦重點實驗室提供）。

1.2 主要儀器及試劑

超凈工作臺（SW－CJ－1F型，蘇凈集團安泰公司），超低溫冰箱（U570型，艾本德），小臺式離心機（PICO17型，美國 THERMO），CO2培養(yǎng)箱（311型，美國 THERMO），細胞計數(shù)器（TC20型，美國BIO-RAD），倒置相差顯微鏡（TS100型，日本Nikon），CO2鋼瓶（咸陽偉麗氣體有限公司），電子天平［PL-303型，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］，全波長酶標儀（PowerWave XS2，美國Bio-tek公司），伯樂細胞計數(shù)板（BIO-RAD 145-0011，上海硅狄科學儀器有限公司）。DMEM高糖培養(yǎng)基（Hyclone，上海聯(lián)碩生物科技有限公司），青鏈霉素混合液（KGY0023，江蘇凱基生物技術(shù)有限公司），胰蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司），胎牛血清（BI，舜冉上海生物科技有限公司），CCK-8檢測試劑盒（日本同仁，北京智杰方遠科技有限公司），乳酸脫氧酶（LDH）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），Na2S2O4（化學成分純品，無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司），PBS（Hyclone，上海研卉生物科技有限公司）。完全培養(yǎng)基配置：44.5 mL DMEM高糖培養(yǎng)基+5 mL胎牛血清+0.5 mL雙抗，現(xiàn)配現(xiàn)用。10 mmol·L-1Na2S2O4培養(yǎng)液的配制：0.0174 g Na2S2O4+10 mL DMEM高糖培養(yǎng)基，按所需濃度稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用。CCK-8混合液的配置：根據(jù)說明書配制，按實際所需配比。

1.3 實驗分組及造模方案

設空白對照組（無細胞+完全培養(yǎng)基），正常對照組（細胞+完全培養(yǎng)基），實驗組（細胞+完全培養(yǎng)基+Na2S2O4）。以5×104個/mL的細胞濃度接種96孔板，每孔100 μL細胞懸液，待培養(yǎng)24 h后，吸去原液，PBS洗2遍，空白對照組和正常對照組給予換液處理，實驗組加入含不同濃度（0.5、1、2、4 mmol·L-1）的 Na2S2O4培養(yǎng)液（每個濃度梯度設6個復孔），置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，然后實驗組吸去培養(yǎng)液，PBS洗2遍，給予完全培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，進行復氧。倒置相差顯微鏡分別觀察正常對照組和實驗組細胞（缺氧1 h，復氧24 h）形態(tài)變化。

1.4 CCK-8檢測細胞存活率

按預實驗結(jié)果選取5×104個/mL細胞濃度，每孔100 μL接種96孔板，培養(yǎng)24 h后，給予不同濃度的Na2S2O4缺氧1 h，復氧 24 h后，將正常對照組和實驗組細胞吸去培養(yǎng)液（移至新的96孔板，用于測定LDH含量），用PBS清洗2遍，加入CCK-8混合液，每孔110 μL混合液，置于細胞培養(yǎng)箱中孵育，用多功能酶標儀檢測CCK-8孵育3 h時的OD值，根據(jù)CCK-8說明書計算細胞存活率。細胞存活率=（實驗孔OD值-空白孔OD值）/（對照孔OD值-空白孔OD值），選取細胞存活率在50%～60%時的Na2S2O4濃度為最佳。

1.5 LDH含量檢測

待Na2S2O4缺氧處理細胞1 h，復氧24 h后，取正常對照組和實驗組細胞培養(yǎng)液，置于96孔板中，每孔20 μL細胞培養(yǎng)液，根據(jù)LDH檢測試劑盒說明書，用2，4－二硝基苯肼顯色法在多功能酶標儀上檢測450 nm處OD值，并根據(jù)說明書計算各組 LDH 含量（U·L-1）。

1.6 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)應用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較用F檢驗，組內(nèi)兩兩比較用LSD-t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Na2S2O4對HT22細胞形態(tài)學影響

利用倒置相差顯微鏡，觀察20倍鏡下細胞形態(tài)。正常對照組細胞良好，細胞胞體飽滿，排列緊密，輪廓清晰，胞體邊緣有光暈，折光性及立體感強，神經(jīng)纖維廣泛連接，連接密集，少許死亡細胞漂?。▓D 1A）。0.5 mmol·L-1Na2S2O4實驗組可見細胞輕度損傷，少量神經(jīng)細胞皺縮，部分神經(jīng)纖維網(wǎng)絡變細、皺縮（圖 1B）。1 mmol·L-1Na2S2O4實驗組可見細胞損傷加重，胞體皺縮，折光性下降，細胞突起減少，死亡細胞增多，部分神經(jīng)纖維變細，細胞間纖維連接減少，可見漂浮的斷裂神經(jīng)纖維團塊（圖 1C）。2 mmol·L-1Na2S2O4實驗組可見細胞損傷明顯加重，細胞皺縮明顯，細胞突起明顯減少，死亡細胞明顯增多，胞體光暈明顯減少，神經(jīng)纖維網(wǎng)絡連接減少，可見成塊細胞團塊和斷裂的神經(jīng)纖維（圖 1D）。4 mmol·L-1Na2S2O4實驗組細胞損傷更為明顯，大部分細胞皺縮、死亡，視野僅可見部分細胞存活，光暈模糊，神經(jīng)纖維連接明顯減少，可見死亡的細胞團塊和斷裂的神經(jīng)纖維（圖 1E）。

2.2 CCK-8法檢測細胞存活率

給予不同濃度的Na2S2O4（0.5、1、2、4 mmol·L-1）進行缺氧損傷1 h，復氧24 h后，加入CCK-8試劑孵育3 h，根據(jù)OD值計算所得的細胞存活率分別為（67±16）%、（65±19）%、（53±15）%、（49±0.9）%，依實驗需求，細胞存活率在50%～60%為最佳，故選擇 2 mmol·L-1的 Na2S2O4進行缺氧/復氧。見圖2。

2.3 不同濃度Na2S2O4作用HT22細胞后上清液中LDH含量比較

隨著Na2S2O4濃度增高，細胞損傷加重。與正常對照組比較，各濃度Na2S2O4組上清液中LDH均升高（P均＜0.001），其中，2、4 mmol·L-1組LDH高于0.5、1 mmol·L-1組（P均＜0.05），4 mmol·L-1組LDH 高于 2 mmol·L-1組（P＜0.05）。見表 1。

3 討論

腦缺血性疾病嚴重危害人類健康，根據(jù)病因不同，腦血管疾病可分為缺血性和出血性病變，而缺血性腦血管病具有發(fā)病率高、致殘率高和復發(fā)率高的特點。因受實驗室及動物實驗限制，建立體外細胞缺血、缺氧/復氧損傷模型成為研究熱點。細胞缺氧是多種缺血缺氧性疾病發(fā)病的關鍵環(huán)節(jié)，建立細胞缺氧模型來模擬疾病關鍵環(huán)節(jié)是從細胞和分子水平研究該類疾病的重要方法[11]，而建立體外細胞缺氧模型方法眾多，Na2S2O4最早是用于研究紅細胞與氧解離的藥物，是一種氧清除劑，可有效清除細胞培養(yǎng)基質(zhì)中的氧，具有操作簡單、成模快速、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點[12]，且Na2S2O4不改變?nèi)芤簆H值，不損傷細胞膜，因此可直接觀察Na2S2O4所致的缺氧狀態(tài)對細胞損傷的情況。但建立不同細胞的缺氧損傷模型所需的Na2S2O4濃度不同，其使用范圍 1～20 mmol·L-1均有報道[13-16]。因此，篩選一個合適濃度的Na2S2O4建立HT22細胞缺氧/復氧模型是本研究的目標。

本研究采用不同濃度的Na2S2O4（0.5、1、2、4 mmol·L-1）對 HT22 細胞進行缺氧損傷 1 h，觀察復氧24 h后的結(jié)果，隨著Na2S2O4濃度的增高，細胞損傷越明顯，死亡細胞增多，神經(jīng)纖維廣泛溶解、斷裂。CCK-8法廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性實驗，其OD值間接反映活細胞數(shù)量。本文應用CCK-8檢測不同濃度Na2S2O4損傷細胞的存活情況，0.5 mmol·L-1Na2S2O4作用1 h即可對HT22細胞產(chǎn)生損傷，但 0.5 mmol·L-1Na2S2O4與1 mmol·L-1Na2S2O4細胞存活率差異無統(tǒng)計學意義，而2 mmol·L-1Na2S2O4可對細胞產(chǎn)生損傷，使其細胞存活率為50%～60%。LDH含量是反映細胞損傷的一種敏感且較為簡便的指標，當細胞凋亡或壞死造成的細胞膜破壞，會使胞漿內(nèi)的LDH釋放到培養(yǎng)液中。因此，可以通過檢測培養(yǎng)液中LDH含量反映細胞損傷情況。在本實驗中，隨著Na2S2O4的濃度增高，培養(yǎng)液中LDH的含量越高，細胞損傷越重，HT22細胞損傷程度與 LDH釋放量成正比[17]，此變化與HT22細胞形態(tài)學及CCK-8檢測的細胞存活率變化相符。

綜上所述，本研究利用形態(tài)學、細胞存活率及LDH的方法，觀察不同濃度Na2S2O4對HT22細胞的損傷情況，依實驗需求，細胞存活率在50%～60%為最佳。因此，2 mmol·L-1Na2S2O4處理 HT22細胞，進行缺氧1 h，復氧24 h可建立有效的缺氧復氧損傷模型，為Na2S2O4誘導HT22細胞缺氧/復氧損傷模型的制備提供了依據(jù)。