張 煒，萬巧鳳，馬 銳，黃 菱，王 麗

（寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病原生物學與醫(yī)學免疫學系，銀川 750004）

枸杞為茄科灌木植物，其成熟果實——枸杞子具有滋補肝腎、益精明目的功效。枸杞多糖（lycium barbarum polysaccharides，LBP）是枸杞子的主要生物活性成分，是由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖6種單糖組成的一種大分子水溶性多糖。近年來廣泛的藥理學研究表明，LBP 具有抗氧化[1-2]、抗腫瘤[3]、降血糖[4]、降血脂[5]、免疫調(diào)節(jié)[6]和神經(jīng)保護[7-8]等作用。樹突狀細胞（dendritic cell，DC）是目前所知抗原提呈能力最強的專職抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC），參與抗原的識別、加工處理與提呈，在免疫應答過程中發(fā)揮至關重要的作用[9]。DC2.4細胞是通過轉(zhuǎn)染癌基因v-myc和v-raf的C57BL/6小鼠骨髓細胞而建立的永生化細胞系[10]，具有很強的吞噬功能，是用于DC研究的一種標準的未成熟細胞系[11]。本研究以未成熟樹突狀DC2.4細胞為研究對象，通過觀察LBP對DC2.4細胞增殖、抗原吞噬及成熟的影響，初步探討LBP發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞 DC2.4是將myc和raf癌基因轉(zhuǎn)染至C57BL/6小鼠骨髓細胞而建立的DC細胞株。DC2.4細胞（AY0006）購自上?；鄯f生物科技有限公司。

1.1.2 藥品 LBP（寧夏啟元藥業(yè)有限公司，純度＞90%），由寧夏醫(yī)科大學劉志宏老師課題組惠贈，用含1‰ DMSO的 RPMI 1640不完全培養(yǎng)基配制成1 g·L-1的LBP母液，再用 0.22 μm 濾器（Millpore）過濾除菌后分裝，貯存于-20℃?zhèn)溆谩?.1.3 試劑 CCK-8試劑盒（東仁化學科技有限公司，貨號：CK04）；脂多糖（LPS，Sigma，批號：L-2880）；胎牛血清（Gibco，貨號：26010074）、RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco，貨號：31870082）；FITC 標記的卵清蛋白（OVA）（北京博奧森生物技術有限公司，貨號：bs-0283P）、PE標記兔抗鼠CD86抗體（北京博奧森生物技術有限公司，貨號：bs-1035R）。

1.2 方法

1.2.1 DC2.4細胞培養(yǎng) 含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)DC2.4細胞，隔天換液。觀察細胞形態(tài)，傳代3～4次后，挑選狀態(tài)良好的細胞備用。

1.2.2 LBP對DC2.4細胞增殖的影響 將DC2.4細胞接種于96孔板，5000個/孔。待細胞貼壁后換用含有5%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)液，同步化培養(yǎng)13～14 h后進行不同處理?？瞻讓φ战M無任何處理；LBP組分別加入終濃度為200μg·mL-1、100 μg·mL-1和 20 μg·mL-1的 LBP（對應高、中、低濃度組）；LPS 組加入終濃度為 5 μg·mL-1的LPS。設置6個復孔/組，在37℃、5%CO2條件下分別培養(yǎng) 12 h、24 h、48 h 后，每孔加入 10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，然后用酶標儀測定570 nm處的吸光值。

1.2.3 LBP對DC2.4細胞吞噬OVA的影響 接種對數(shù)生長期DC2.4細胞于12孔板，3×105個/mL，待細胞貼壁后進行不同處理。空白對照組無任何處理；LBP 組分別加入終濃度為 200 μg·mL-1、100 μg·mL-1和 20 μg·mL-1的 LBP，于 5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)48 h后，每孔加入終濃度為50 μg·mL-1的 FITC-OVA 無血清培養(yǎng)基 2 mL。再繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，用4℃預冷的PBS液終止反應，經(jīng)消化、離心后收集細胞，再用預冷的PBS洗滌2次，最后取500 μL預冷PBS重懸細胞，用流式細胞儀檢測吞噬熒光素的吞噬細胞百分比。

1.2.4 LBP對DC2.4細胞成熟標志分子CD86的影響 接種DC2.4細胞于12孔板，3×105個/mL，待細胞貼壁后進行不同處理。空白對照組無任何處理；LBP 組加入終濃度為 100 μg·mL-1的 LBP；LPS 組加入終濃度為 5 μg·mL-1的 LPS；LPS+LBP組加入終濃度為 5 μg·mL-1的 LPS 及 100 μg·mL-1的 LBP。設置3個復孔/組，在 37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h后，消化、收集各組細胞。每孔分別加入終濃度為5 mg·L-1的PE標記CD86抗體1 μL，37℃、避光孵育 30 min，然后用預冷 PBS洗3遍，最后取500 μL預冷PBS重懸細胞，用流式細胞儀進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件處理與分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，各組均數(shù)比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 DC2.4細胞的觀察

倒置顯微鏡下觀察DC2.4細胞，為貼壁黏附生長細胞，其形態(tài)與小鼠骨髓來源的DC形態(tài)特征相似，符合不成熟DC的特點[12]。細胞形態(tài)如圖1所示。

2.2 LBP對DC2.4細胞增殖的影響

CCK-8檢測結(jié)果顯示：空白對照組培養(yǎng)24 h和48 h后，DC2.4細胞增殖（P＜0.05）。加入LPS后，在12 h、24 h及48 h三個時間點，DC2.4細胞均增殖（P＜0.05）。LBP 組高、中濃度組在 12 h、24 h及48 h三個時間點均沒能促進DC2.4細胞增殖，增殖水平接近空白對照細胞；低濃度組在24h和48h均可促進DC2.4細胞增殖（P＜0.05）。見圖2。

2.3 LBP對DC2.4細胞吞噬OVA的影響

抗原吞噬結(jié)果如圖3所示，高、中、低濃度LBP均可促進DC2.4細胞吞噬抗原，吞噬細胞百分比分別為28.2%、30.2%和23.3%，均高于空白對照組（18.9%）（P均＜0.05）。

2.4 LBP對LPS誘導的DC2.4成熟標志分子CD86的影響

檢測結(jié)果如圖4所示，單獨使用LPS或LBP，均可上調(diào) CD86表達（P＜0.01）；聯(lián)合使用LPS和LBP后，CD86的表達低于LPS組（P＜0.05）。

3 討論

DC是機體中最重要的APC，它不僅能激活免疫應答，而且能誘導免疫耐受，發(fā)揮著維持機體免疫平衡的重要作用。DC的功能與其所處的發(fā)育階段有著密切的關系——未成熟DC捕獲和加工抗原的能力比較強，但提呈抗原的能力非常弱；成熟DC抗原提呈的能力比較強，但捕獲和加工抗原的能力非常弱[11]。未成熟DC在攝取抗原或受到LPS等因素刺激后，呈遞抗原的能力逐漸增強，而攝取、加工處理抗原的能力逐漸減弱，最終發(fā)育為成熟樹突狀細胞[13]。本實驗所用DC2.4細胞是先用GM-CSF轉(zhuǎn)染C57BL/6小鼠骨髓細胞，然后再轉(zhuǎn)染myc和raf癌基因而建立的永生化細胞株，其攝取抗原后可從未成熟狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒鞝顟B(tài)[14]。OVA是抗原吞噬研究中常用的外源性抗原，與異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）偶聯(lián)后，可被未成熟 DC2.4細胞吞噬。通過流式細胞儀檢測吞噬熒光素的吞噬細胞百分率，可間接反映DC2.4細胞吞噬抗原的能力[15]。CD80和CD86是重要的共刺激分子，對T細胞和樹突狀細胞的相互作用具有重要的影響[16]，在DC成熟過程中，CD86表達上調(diào)，使DC與T細胞接觸持久而穩(wěn)定[17]。

本研究結(jié)果顯示：在LBP對DC2.4細胞增殖影響實驗中，100 μg·mL-1及 200 μg·mL-1LBP 在作用12 h、24 h、48 h后均不能促進DC2.4增殖，而 20 μg·mL-1LBP 在 24 h、48 h 均可促進 DC2.4細胞增殖，說明中、高濃度LBP具有維持細胞數(shù)量穩(wěn)態(tài)效應。在LBP對DC2.4吞噬抗原影響實驗中，20 μg·mL-1、100 μg·mL-1及 200 μg·mL-1LBP均可促進DC2.4細胞吞噬抗原，以100 μg·mL-1LBP促抗原吞噬作用最佳。在LBP對DC2.4成熟影響實驗中，LPS和LBP均可上調(diào)DC2.4細胞表面CD86的表達，但LPS和LBP聯(lián)合使用后，CD86的表達低于單用LPS，說明LBP可適度抑制LPS誘導促進DC2.4成熟作用。

綜上所述，LBP發(fā)揮抗炎免疫調(diào)節(jié)作用的生物學機制可能與影響DC的功能相關。本實驗僅僅初步探究了LBP對DC2.4部分功能的影響作用，下一步將深入探究其對LPS誘導DC2.4的炎癥信號轉(zhuǎn)導途徑中關鍵分子的影響以及對共培養(yǎng)的初始T細胞的影響，以期進一步確定LBP發(fā)揮抗炎效應的免疫調(diào)節(jié)機制。