龐勝美，吳文文，丁雪燕，劉思國，王曉鈞，段強(qiáng)德*，朱國強(qiáng)*

（1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009；3. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069）

鞭毛是位于細(xì)菌表面的一種長絲狀附屬物，由基體部（Basal body）、鞭毛鉤（Hook）和鞭毛絲（Filament）3 部分組成，其中fliC 是鞭毛蛋白編碼基因的主要結(jié)構(gòu)成分。鞭毛蛋白是一種重要的病原體相關(guān)分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），能激活細(xì)胞表面Toll 樣受體5（Toll-like receptor 5，TLR5）[1]和/或細(xì)胞溶質(zhì)NOD 樣受體蛋白4（NLR family CARD domain-containing protein 4，NLRC4）[2]，發(fā)揮免疫佐劑活性[3-4]。作為一種新型分子免疫佐劑，鞭毛蛋白可通過不同免疫形式和免疫途徑同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體先天性免疫和獲得性免疫反應(yīng)。鑒于鞭毛蛋白能夠輔助誘導(dǎo)有效的抗原特異性反來對抗不同的病毒和細(xì)菌等病原體，目前其已經(jīng)較為廣泛的應(yīng)用于細(xì)菌、病毒和寄生蟲等多種病原體的抗感染疫苗佐劑研發(fā)。同時(shí)，鞭毛蛋白免疫佐劑活性也為腫瘤疫苗及癌癥免疫治療的開發(fā)提供了新策略[5]。

1 細(xì)菌鞭毛蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

對沙門氏菌鞭毛蛋白的晶體結(jié)構(gòu)研究顯示，其全長由495 個(gè)氨基酸殘基組成，包括4 個(gè)線性相關(guān)的結(jié)構(gòu)域：兩個(gè)高度保守的核心結(jié)構(gòu)域（D0、D1）和兩個(gè)超變結(jié)構(gòu)域（D2、D3）[6]。鞭毛蛋白NH2-端和COOH-端鏈形成α 螺旋結(jié)構(gòu)，組成了位于鞭毛絲中心的D0 和D1 結(jié)構(gòu)域；而可變區(qū)形成β 折疊結(jié)構(gòu)，組成了位于鞭毛絲外表面的D2 和D3 結(jié)構(gòu)域（圖1）。鞭毛蛋白不同結(jié)構(gòu)域分別發(fā)揮不同的作用。鞭毛蛋白D0 結(jié)構(gòu)域在不同種屬細(xì)菌中高度保守，是由鞭毛蛋白NH2-端和COOH-末端的50 個(gè)氨基酸共同組成。D0 結(jié)構(gòu)域中位于第aa89～aa96 位氨基酸殘基關(guān)鍵位點(diǎn)對TLR5 信號識別傳導(dǎo)尤為重要，而位于其COOH末端最后35個(gè)氨基酸與其介導(dǎo)的NLRC4受體信號傳導(dǎo)相關(guān)[7-8]。D1結(jié)構(gòu)域由位于NH2-末端第aa56～aa176位氨基酸殘基以及位于COOH-末端第aa402～aa450 位氨基酸殘基共同組成。其中位于NH2-端的第aa90～aa97位氨基酸（QRVRELAV）形成高度保守的基序，該基序與鞭毛蛋白高親和力結(jié)合TLR5 以及激活TLR5 的信號傳導(dǎo)途徑密切相關(guān)。D2結(jié)構(gòu)域由位于NH2-端第aa177～aa189 和COOH 端第aa284～aa401 位氨基酸殘基共同組成，形成兩個(gè)短螺旋β-鏈，兩端分別連接D1 和D3 結(jié)構(gòu)域。D2 結(jié)構(gòu)域可能是髓樣分化蛋白88（Myeloid differential protein-88，MyD88）非依賴性IgG1 抗鞭毛蛋白反應(yīng)中最關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)域[9]。D3 結(jié)構(gòu)域由第aa190～aa283 氨基酸殘基組成，主要是一段短螺旋折疊的β-鏈。D3 結(jié)構(gòu)域決定鞭毛蛋白的各種H抗原亞型，該結(jié)構(gòu)域與鞭毛蛋白免疫原性相關(guān)，同時(shí)對維持鞭毛細(xì)絲穩(wěn)定性也發(fā)揮著重要作用[10]?？傊?，明晰鞭毛蛋白各個(gè)結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可以為進(jìn)一步研究它們的功能提供重要信息。

圖1 沙門氏菌鞭毛蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖

2 鞭毛蛋白的免疫佐劑活性及其機(jī)制

鞭毛蛋白可以通過激活細(xì)胞表面的TLR5 途徑和/或胞內(nèi)NLRC4 途徑，誘導(dǎo)機(jī)體促炎因子的產(chǎn)生，激發(fā)機(jī)體的先天性免疫反應(yīng)，從而發(fā)揮其免疫佐劑活性（圖2）。TLR5 表達(dá)于多種細(xì)胞上，包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（DC）、上皮細(xì)胞和淋巴結(jié)（LN）基質(zhì)細(xì)胞等[12-13]。這些免疫細(xì)胞通過TLR5 同源二聚體或異源二聚體（TLR4/TLR5）復(fù)合物，識別胞外的鞭毛蛋白單體，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子、一氧化氮（NO）、H2O2、趨化因子和宿主防御蛋白等[14]。促炎因子進(jìn)一步通過激活共刺激分子和粘附分子信號通道而促進(jìn)機(jī)體的獲得性免疫應(yīng)答[15]。鞭毛蛋白TLR5 信號途徑的激活包括MyD88 依賴性途徑或MyD88 非依賴性途徑。MyD88 依賴性途徑首先是鞭毛蛋白與細(xì)胞表面TLR5 結(jié)合誘導(dǎo)TLR5 的二聚化。然后，MyD88 被招募到TLR5 的細(xì)胞質(zhì)部分并與之結(jié)合，隨后通過白細(xì)胞介素-1 受體相關(guān)激酶（Interleukin-1 receptor-associated kinase，IRAK）、腫瘤壞死因子受體活化因子6（TNF receptor-associated factor，TRAF6）和TGF-β 相關(guān)激酶1（TGF-β associated kinase 1，TAK1）將信號傳遞給有絲分裂原激活蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）和IκB激酶級聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)下游炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。MyD88非依賴性途徑則首先是TLR4/TLR5異二聚體通過干擾素應(yīng)答因子3（Interferon response factor 3，IRF3）途徑誘導(dǎo)IFN-β 的產(chǎn)生，進(jìn)一步激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，Stat1）促進(jìn)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（Inducible NO synthase，iNOS）基因轉(zhuǎn)錄，并生成NO[16-17]。

圖2 鞭毛蛋白調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)的機(jī)制圖[22]

除了激活胞外TLR5 信號通路外，鞭毛蛋白還可以激活胞質(zhì)內(nèi)NLRC4 信號通路[18]。核苷酸結(jié)合和寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體（Nucleotide-binding and oligomerization domain-like receptor，NLR）通常包含3 個(gè)結(jié)構(gòu)域：NH2-端的Caspase 募集結(jié)構(gòu)域（CARD）、中央的核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域（Nucleotide-binding oligomerization domain，NOD）和COOH 端的富含亮氨酸重復(fù)序列（Leucine rich repeat，LRR）結(jié)構(gòu)域。進(jìn)入胞質(zhì)中的鞭毛蛋白首先與NLR 家族的兩個(gè)受體凋亡抑制蛋白5 和6（NLR apoptosis-inhibitory proteins 5 and 6，NAIP5 和NAIP6）結(jié)合形成復(fù)合物，復(fù)合物隨后與NLRC4 結(jié)合，分泌炎性小體，進(jìn)一步激活Caspase-1信號通道，促進(jìn)IL（Interleukin）-1β 和IL-18 的加工和分泌[19-20]，從而發(fā)揮鞭毛蛋白的免疫活性。NLRC4 的激活還可通過多種途徑調(diào)節(jié)機(jī)體的獲得性免疫應(yīng)答，但是其具體分子機(jī)制目前尚不清楚[21]。

TLR5 與NLRC4 信號通路除了分別介導(dǎo)鞭毛蛋白的宿主免疫應(yīng)答外，該兩個(gè)信號通路之間也能相互調(diào)節(jié)[23]。研究顯示，鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白第aa89～aa96 位氨基酸殘基突變后，鞭毛蛋白不僅與TLR5 和NLRC4 受體結(jié)合能力降低，而且其免疫佐劑活性也顯著降低[24]，這表明該基序既是TLR5 識別的關(guān)鍵位點(diǎn)，同時(shí)也是鞭毛蛋白發(fā)揮免疫佐劑活性的關(guān)鍵位點(diǎn)。當(dāng)TLR5 信號通道受阻時(shí)，鞭毛蛋白還可通過NLRC4 信號通道激活機(jī)體的先天性免疫反應(yīng)[25]。此外，研究顯示TLR5 活性降低會(huì)伴隨著NLRC4 的信號降低，進(jìn)而降低鞭毛蛋白的佐劑活性[24]；而NLRC4 信號通道的激活則可以負(fù)調(diào)控鞭毛蛋白TLR5 信號通道介導(dǎo)的免疫應(yīng)答[7]。

雖然鞭毛蛋白作為一種高效的免疫佐劑，可通過TLR5 和NLRC4 信號通路誘導(dǎo)機(jī)體的先天性免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答。但目前尚不清楚TLR5 和/或NLRC4 信號通道的激活對宿主防御細(xì)菌感染的作用效果和具體作用機(jī)制。因此，進(jìn)一步研究TLR5和NLRC4 信號通路之間的相互作用，將有助于增強(qiáng)對鞭毛蛋白介導(dǎo)機(jī)體的先天性免疫應(yīng)答復(fù)雜機(jī)制的理解，并設(shè)計(jì)出基于鞭毛蛋白的更為合理、高效的疫苗。

3 鞭毛佐劑的臨床應(yīng)用

鑒于細(xì)菌鞭毛蛋白的生物學(xué)特性，其作為新型分子免疫佐劑，具有諸多的優(yōu)勢。首先，傳統(tǒng)鋁膠油乳佐劑主要是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)，而鞭毛蛋白可以同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)[21,26]。其次，由于其結(jié)構(gòu)的特殊性，可以在其NH2 端、COOH 端或中間的高變區(qū)插入外源抗原，而不影響其結(jié)構(gòu)和功能[27]。再次，鞭毛蛋白和外源抗原的融合表達(dá)可以保證抗原-佐劑遞送至相同的表達(dá)TLR5 的抗原遞呈細(xì)胞（APC），從而顯著增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答水平。此外，由于鞭毛蛋白本身的免疫佐劑活性特性，鞭毛蛋白和外源抗原作為融合蛋白表達(dá)還可以大大減少疫苗生產(chǎn)時(shí)間、免疫佐劑用量，從而節(jié)約生產(chǎn)成本[28]。

鞭毛蛋白作為一種極具吸引力的新型免疫佐劑，可以與外源抗原以多種形式結(jié)合，以增強(qiáng)抗原的免疫效果。在某些情況下，鞭毛蛋白和抗原混合接種機(jī)體，可以同時(shí)誘導(dǎo)針對外源抗原和鞭毛蛋白的免疫反應(yīng)[29-30]。如將鼠疫耶爾森氏菌的YopE 基因與沙門氏菌鞭毛蛋白基因fliC 混合免疫，比單獨(dú)免疫鼠疫耶爾森氏菌的YopE 基因誘導(dǎo)機(jī)體更強(qiáng)烈的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，對小鼠提供的保護(hù)率達(dá)到83%，而單獨(dú)接種YopE 對小鼠僅提供50%的保護(hù)率[31]。用輪狀病毒保守的VP6 抗原與鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白fliC 基因混合免疫小鼠，只需要低水平的鞭毛蛋白表達(dá)就可以顯著預(yù)防新生小鼠感染輪狀病毒，保護(hù)率可以達(dá)80%[32]。但有時(shí)需要將外源抗原與鞭毛蛋白融合表達(dá)才能誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)[33]。由于鞭毛蛋白具有優(yōu)良的可塑性，可以將鞭毛蛋白基因fliC 與抗原組合構(gòu)建融合蛋白，而不會(huì)破壞各自獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)以及生物學(xué)活性。外源抗原可以與鞭毛蛋白NH2-端或COOH-末端連接，或者替換鞭毛蛋白的高變區(qū)。作為一種有效的抗原遞呈載體，鞭毛蛋白與外源抗原蛋白融合表達(dá)，可以顯著提高該抗原的免疫效果。例如將流感病毒的HA 抗原融合至鞭毛蛋白的NH2-端或COOH-末端，均能刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)[34]。此外，將H5N1 亞型流感病毒的HA 球狀頭取代鞭毛蛋白的高變區(qū)構(gòu)建融合蛋白，可以在免疫小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)大、持久的中和抗體，保護(hù)小鼠抵抗H5N1 流感病毒感染可達(dá)8 個(gè)月以上[35]。Li 等人將豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的Spike（S）蛋白的膠原酶當(dāng)量（COE）結(jié)構(gòu)域替換重組沙門氏菌鞭毛蛋白的D3結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建具有聚合能力和TLR5 激動(dòng)劑活性的rSF-COE-3D 重組蛋白，不僅顯著激發(fā)小鼠的局部黏膜、全身性體液和T 細(xì)胞免疫應(yīng)答，而且還顯著提高針對PEDV 的中和抗體滴度[36]。與將鞭毛蛋白和目的抗原混合接種機(jī)體相比，將目的抗原與鞭毛蛋白融合表達(dá)更有利于抗原和佐劑同時(shí)傳遞給表達(dá)TLR5 的宿主抗原遞呈細(xì)胞（DCs），從而提高抗原的遞呈效率，增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)[26]。鑒于目的抗原-鞭毛蛋白融合蛋白可以通過TLR5 信號通路更好的激活DCs，因此這種融合形式可能成為構(gòu)建疫苗的一種更優(yōu)的策略。

鞭毛蛋白作為免疫佐劑，不論是通過口服途免疫徑還是注射免疫途徑，均能發(fā)揮其免疫佐劑活性，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)[37-38]。細(xì)菌鞭毛蛋白可以激活黏膜組織中表達(dá)TRL5 的免疫細(xì)胞，從而發(fā)揮其黏膜佐劑活性，以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體[39-40]。目前，鞭毛蛋白作為一種有效的黏膜佐劑已經(jīng)應(yīng)用于新城疫[41]、流感[42]、痘病毒病[43]、艱難梭菌病[44]和惡性瘧原蟲病[45]等疫苗的研發(fā)。

此外，鞭毛蛋白以不同的注射方式免疫時(shí)，也均能發(fā)揮其免疫佐劑效應(yīng)。如將UPECI89 I 型菌毛黏附亞單位的fimH 基因和CFT057 鞭毛蛋白的flic 基因融合表達(dá)，將該融合蛋白經(jīng)皮下注射途徑免疫小鼠可以誘導(dǎo)其高水平的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，并且顯著減少了尿道致病性大腸桿菌（UPEC）在小鼠膀胱中的定植[46]。將狂犬病病毒的病毒樣顆粒（VLPs）與鞭毛蛋白基因fliC 的NH2-端嵌合，利用基因工程技術(shù)融合表達(dá)，通過肌肉注射小鼠或犬，均能夠快速誘導(dǎo)產(chǎn)生狂犬病病毒的中和抗體，并激發(fā)大量的CD4+T 和CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)，抵抗狂犬病病毒的感染[47]。此外，將缺失高變區(qū)的鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白（STF2Δ）融合西尼羅河病毒（WNV）的包膜（E）蛋白EIII 結(jié)構(gòu)域，將該嵌合蛋白（STF2D.EIII）經(jīng)腹腔注射小鼠，能夠誘導(dǎo)小鼠持久有效的WNV-EIII 特異性IgG抗體反應(yīng)，從而有效地抵抗WNV 的感染[48]。

鞭毛蛋白作為免疫佐劑除較為廣泛地應(yīng)用于常見的抗細(xì)菌、病毒和寄生蟲等多種不同病原體感染，最近研究還顯示鞭毛蛋白在抗腫瘤、抗輻射、治療藥物成癮、I 型過敏反應(yīng)等方面同樣發(fā)揮著重要的作用，但是其具體的作用機(jī)制尚不明確[49-51]。

雖然鞭毛蛋白作為免疫佐劑在實(shí)驗(yàn)室取得了很好的效果，但是目前其在臨床應(yīng)用上仍有一定的局限性。一方面由于鞭毛蛋白的內(nèi)在抗原性，鞭毛蛋白作為免疫佐劑能夠誘導(dǎo)針對其自身的特異性抗體，從而中和其觸發(fā)的先天性免疫的應(yīng)答能力，進(jìn)而影響其免疫佐劑活性。另一方面，鞭毛蛋白是一些病原菌重要的毒力因子，可能會(huì)加劇一些疾病進(jìn)程。已有研究表明，鞭毛蛋白的表達(dá)與腸道炎癥、肺部損傷等炎癥性疾病相關(guān)[52-53]。因此，進(jìn)一步深入研究鞭毛蛋白發(fā)揮免疫佐劑活性的分子機(jī)制對于其的臨床應(yīng)用有重要意義。目前普遍認(rèn)為，合理降低鞭毛蛋白的劑量、構(gòu)建融合蛋白或者將鞭毛蛋白與其他TLR 激動(dòng)劑或NLRs 聯(lián)合使用可以有效減少甚至避免這些副作用，從而更好地發(fā)揮其佐劑效應(yīng)[22]。

4 小結(jié)與展望

鞭毛蛋白是PAMP 中重要的成員之一，是天然免疫細(xì)胞對病原體特異性識別的分子基礎(chǔ)。作為一種新型的分子免疫佐劑，鞭毛蛋白的多結(jié)構(gòu)域賦予了其N 端或C 端以及高變區(qū)與抗原融合的特性，通過激活胞外的TLR5 途徑和/或胞內(nèi)的NLRC4 途徑，進(jìn)而激活機(jī)體的先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。鞭毛蛋白可以通過多種免疫形式和免疫途徑增強(qiáng)與其共同免疫的外源抗原的免疫原性，目前細(xì)菌鞭毛蛋白作為免疫佐劑已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒和寄生蟲等多種疾病疫苗的研發(fā)。除了作為疫苗佐劑外，鞭毛蛋白在抗腫瘤、抗輻射和治療藥物成癮等方面也取得較好的研究進(jìn)展。但是，市場上目前還沒有批準(zhǔn)可使用或銷售的鞭毛蛋白佐劑疫苗，只有重組鞭毛蛋白-流感疫苗已經(jīng)進(jìn)入II 期臨床試驗(yàn)，免疫結(jié)果顯示該疫苗具有良好的免疫原性、耐受性和安全性[54]。本實(shí)驗(yàn)室正在探究不同血清型的細(xì)菌鞭毛蛋白以及鞭毛蛋白不同結(jié)構(gòu)域免疫佐劑活性能力的差異性，研究結(jié)果表明不同血清型大腸桿菌的鞭毛蛋白在體外和體內(nèi)具有相同的免疫佐劑活性；而對鞭毛蛋白不同結(jié)構(gòu)域免疫佐劑活性的研究表明，鞭毛蛋白體外TLR5 受體活性需要完整的鞭毛蛋白結(jié)構(gòu)（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。后續(xù)將要在體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果。隨著對鞭毛蛋白發(fā)揮免疫佐劑活性機(jī)制的深入闡釋，將來會(huì)有更多的基于鞭毛蛋白為佐劑的疫苗進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用中。另外，以鞭毛蛋白某一結(jié)構(gòu)域或特定功能氨基酸殘基位點(diǎn)作為新型分子佐劑也值得關(guān)注和研究。