陳余平，鄭華章，周飛，胡鐵軍

(余姚市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)總站，浙江 余姚 315400)

微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最活躍的組成部分，是土壤養(yǎng)分循環(huán)的重要驅(qū)動(dòng)力。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、生物量等可以反映土壤質(zhì)量與土壤肥力的演變趨勢(shì)，常被用作評(píng)價(jià)土壤健康的重要指標(biāo)[1]。土壤微生物，特別是細(xì)菌群落的多樣性在土壤生態(tài)系統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)元素的循環(huán)、植物病蟲(chóng)害防治，及土壤肥力的保持等方面發(fā)揮著重要的作用。耕作方式和作物類(lèi)型的變化均會(huì)改變土壤微生物群落特征[2]，因此，選擇合理的栽培措施，調(diào)節(jié)土壤微生物群落組成是保障現(xiàn)代農(nóng)業(yè)穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)和作物安全的重要舉措之一。施肥會(huì)直接或間接地改變農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的養(yǎng)分平衡與供應(yīng)狀況，進(jìn)而影響土壤的物理、化學(xué)、生物學(xué)特性。研究發(fā)現(xiàn)，施用有機(jī)物料能顯著提高土壤微生物量和菌群數(shù)，但對(duì)不同菌群的影響程度有所差異[3-4]。從生產(chǎn)實(shí)踐上看，明確不同種植制度、土地利用狀況，以及特定土壤類(lèi)型下施用有機(jī)肥對(duì)土壤生物學(xué)性狀的影響，對(duì)于農(nóng)田土壤培肥、養(yǎng)分資源的高效利用等均具有現(xiàn)實(shí)意義。針對(duì)浙江省濱海圍涂區(qū)域的種植結(jié)構(gòu)和施肥現(xiàn)狀，以余姚市濱?；页蓖翞檠芯繉?duì)象，設(shè)計(jì)連續(xù)3 a的定位試驗(yàn)，引入生物高通量測(cè)序技術(shù)，考查不同輪作和施用有機(jī)肥處理?xiàng)l件下土壤微生物種群的變化情況，以期為農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)調(diào)整、土壤地力培肥提供借鑒與參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)概況

試驗(yàn)在余姚市小曹娥鎮(zhèn)佳云西蘭花專(zhuān)業(yè)合作社進(jìn)行。試驗(yàn)地塊屬于典型的加工蔬菜種植區(qū)，供試土壤為濱?；页蓖?，進(jìn)行連續(xù)3 a的包含輪作和施用有機(jī)肥處理的大田裂區(qū)試驗(yàn)。各處理的輪作方式和有機(jī)肥施用情況簡(jiǎn)述如下：T1，春、秋、冬均種植綠花菜，不施用商品有機(jī)肥；T2，春綠花菜-單季晚稻，年商品有機(jī)肥施用量7 500 kg·hm-2；T3，春綠花菜-單季晚稻，不施用商品有機(jī)肥；T4，冬綠花菜-早稻，年商品有機(jī)肥施用量7 500 kg·hm-2；T5，冬綠花菜-早稻，不施用商品有機(jī)肥；T6，冬綠花菜-菜用大豆，不施用商品有機(jī)肥；T7，雪菜-四季豆-單季晚稻，年商品有機(jī)肥施用量7 500 kg·hm-2；T8，雪菜-四季豆-單季晚稻，不施用商品有機(jī)肥；T9，雪菜-四季豆-夏玉米，不施用商品有機(jī)肥。

1.2 樣品采集

試驗(yàn)共進(jìn)行3 a，于2019年11月中旬最后一茬作物收獲后采集土壤樣品。各小區(qū)以“S”形8點(diǎn)采集耕層土壤，混為一個(gè)土樣，用冰盒保存，并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。剔去植物根系、可見(jiàn)動(dòng)物殘?bào)w和石粒等，均勻混合，平鋪，取5點(diǎn)，放入樣品試管中。每個(gè)土壤樣品取樣3～5 g，然后由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行土壤微生物群落多樣性測(cè)序和交互式分析。

1.3 測(cè)定方法

土壤細(xì)菌群落由16S rRNA測(cè)序，引物為338F_806R；真菌由18S rRNA測(cè)序，引物為ITS1F_ITS2R。完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的DNA基因組純度。PCR擴(kuò)增，采用TransGen AP221-02：TransStartFastpfuDNA Polymerase試劑盒，20 μL反應(yīng)體系，在ABI GeneAmp?9700型PCR儀上進(jìn)行。采用Miseq測(cè)序系統(tǒng)測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用Usearch (version 7.1)軟件，將測(cè)序分析結(jié)果聚類(lèi)為用于物種分類(lèi)的OTU(操作分類(lèi)單元)，并對(duì)所有樣品進(jìn)行抽平。采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析，將置信度閾值設(shè)為0.7，選用Silva(Release128 http://www.arb-silva.de)數(shù)據(jù)庫(kù)得到分類(lèi)學(xué)信息。利用Mothur(version 1.31.2)軟件進(jìn)行α多樣性分析，經(jīng)Rank-Abundance曲線分析，證實(shí)物種豐富度和群落均勻度符合要求。經(jīng)群落組分析，得相對(duì)豐度。利用FUNGuild預(yù)測(cè)分析真菌物種功能性。

2 結(jié)果與分析

2.1 輪作對(duì)濱海灰潮土土壤微生物種群的影響

經(jīng)連續(xù)3 a的旱旱、水旱輪作后，基于土壤樣品檢測(cè)分析數(shù)據(jù)，具體考查T(mén)1和T3(第1組)、T6和T5(第2組)、T9和T8(第3組)等3組輪作方式下濱?；页蓖镣寥牢⑸锓N群的變化情況。

2.1.1 多樣性分析

細(xì)菌、真菌的豐富度實(shí)際觀測(cè)值(Sobs值)代表土壤樣本中微生物物種的豐富程度，也可理解為微生物物種的數(shù)量。經(jīng)Miseq測(cè)序、α多樣性分析，3 a輪作后試驗(yàn)各處理細(xì)菌、真菌的Sobs值變化情況如表1所示?？梢钥闯觯航?jīng)連續(xù)3 a水旱輪作(T3、T5、T8)后，相應(yīng)組別下土壤微生物中的細(xì)菌物種要比旱旱輪作(T1、T6、T9)的豐富，高出5.90%～16.16%。對(duì)于真菌而言，除T1與T3處理的Sobs值相近外，其余2組也同樣表現(xiàn)為水旱輪作后土壤微生物中的真菌物種要比旱旱輪作后的豐富。這是因?yàn)樗递喿髂Ｊ较卵退疇顟B(tài)的微生物總數(shù)、細(xì)菌、放線菌數(shù)量高于濕潤(rùn)狀態(tài)[5]。試驗(yàn)結(jié)果表明，水旱輪作比旱旱輪作有利于豐富土壤微生物的物種多樣性，有助于增加土壤的微生物量碳、氮，進(jìn)而提高土壤肥力。

表1 輪作條件下濱?；页蓖镣寥兰?xì)菌、 真菌的Sobs值

2.1.2 群落組成分析

在門(mén)分類(lèi)學(xué)水平上統(tǒng)計(jì)各樣本的物種豐度。經(jīng)3 a連續(xù)輪作后檢測(cè)分析采集的土壤樣品，保留累計(jì)豐度在97%以上的群落組成，得到18個(gè)門(mén)的細(xì)菌種群和11個(gè)門(mén)的真菌種群。各處理18個(gè)門(mén)細(xì)菌種群的豐度變化如圖1所示：第1～3組中，水旱輪作后土壤中的綠屈撓菌門(mén)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)、Patescibacteria、WS2豐度較旱旱輪作下增加，放線菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、Rokubacteria豐度下降(降幅3.28%～46.19%)。各處理11個(gè)門(mén)真菌種群的豐度變化如圖2所示：從旱旱輪作改為水旱輪作后，所有組別相應(yīng)土壤的絲孢菌門(mén)豐度均下降(降幅6.88%～75.27%)；在第1組和第3組中，從旱旱輪作改為水旱輪作后，隱真菌門(mén)、絲足蟲(chóng)類(lèi)和未經(jīng)分類(lèi)的真菌豐度值均增加，而子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)的豐度值下降。

圖1 輪作條件下濱海潮土的細(xì)菌豐度

圖2 輪作條件下濱海潮土的真菌豐度

不同的輪作方式，會(huì)導(dǎo)致土壤微生物種群比例發(fā)生變化。土壤微生物種群豐度值上升，說(shuō)明這種輪作方式適宜于該種群的生長(zhǎng)，反之則不利于該種群的生長(zhǎng)。水旱輪作轉(zhuǎn)換過(guò)程中水分的變化可調(diào)控土壤中某些細(xì)菌種群的數(shù)量，特別是能促進(jìn)較適應(yīng)惡劣環(huán)境的光異養(yǎng)細(xì)菌的生長(zhǎng)，但對(duì)好氧的細(xì)菌和腐生菌卻有抑制作用。水旱輪作對(duì)真菌(被孢霉門(mén)除外)的影響不盡一致。本研究3組處理中水稻的種植季節(jié)不同：1個(gè)是種早稻，另外2個(gè)是種單季晚稻。對(duì)比3組處理中早稻與晚稻季門(mén)水平上細(xì)菌與真菌的豐度變化，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌豐度變化表現(xiàn)一致的數(shù)量要多于真菌，這說(shuō)明真菌對(duì)土壤水分變化的敏感性要高于細(xì)菌。

2.1.3 真菌的FunGuild功能分類(lèi)統(tǒng)計(jì)

FunGuild基于目前已發(fā)表的文獻(xiàn)或權(quán)威網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)營(yíng)養(yǎng)方式將真菌分為病理營(yíng)養(yǎng)型、共生營(yíng)養(yǎng)型與腐生營(yíng)養(yǎng)型3大類(lèi)。如表2所示，旱旱輪作改為水旱輪作后，病理營(yíng)養(yǎng)型土壤真菌數(shù)量顯著降低，共生營(yíng)養(yǎng)型真菌數(shù)量有所下降，而腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌數(shù)量明顯上升。這說(shuō)明水旱輪作在一定程度上有助于減少農(nóng)作物病蟲(chóng)害。

表2 輪作條件下濱海灰潮土土壤真菌 FunGuild分類(lèi)

2.2 施用有機(jī)肥對(duì)濱?；页蓖镣寥牢⑸锓N群的影響

在旱旱或水旱輪作一致情況下，分析連續(xù)3 a施用商品有機(jī)肥(T2、T4、T7)和不施用有機(jī)肥(T3、T5、T8)對(duì)濱?；页蓖镣寥牢⑸锓N群的影響。以T2和T3對(duì)比作為第4組，T4和T5對(duì)比作為第5組，T7和T8對(duì)比作為第6組。

2.2.1 多樣性分析

經(jīng)Miseq測(cè)序、α多樣性分析，各處理細(xì)菌、真菌的Sobs值如表3所示?？梢钥闯觯B續(xù)3 a施用有機(jī)肥處理的土壤中細(xì)菌物種更豐富。對(duì)于真菌而言，除第6組外，施用有機(jī)肥處理的土壤中真菌物種也更豐富。這說(shuō)明施用有機(jī)肥有利于增加土壤中微生物的多樣性。

表3 施用有機(jī)肥對(duì)濱?；页蓖镣寥兰?xì)菌、 真菌sobs值的影響

2.2.2 群落組成分析

經(jīng)3 a連續(xù)不同施肥處理后，檢測(cè)分析采集的土壤樣品，保留累計(jì)豐度在97%以上的群落組成，得到18個(gè)門(mén)的細(xì)菌種群和11個(gè)門(mén)的真菌種群。各處理18個(gè)門(mén)類(lèi)細(xì)菌種群的豐度變化如圖3所示：連續(xù)施用有機(jī)肥后，土壤中的厚壁菌門(mén)、Entotheonellaeota豐度增加(增幅1.25%～67.47%)，酸桿菌門(mén)、疣微菌門(mén)、WS2豐度下降(降幅1.72%～584%)。各處理11個(gè)門(mén)類(lèi)真菌種群的豐度變化如圖4所示：連續(xù)施用有機(jī)肥后，土壤中的子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)、絲孢菌門(mén)豐度增加(增幅0.66%～521.16%)，油壺菌門(mén)和未經(jīng)分類(lèi)的真菌豐度下降(降幅3.16%～39.31%)。

圖3 施用有機(jī)肥對(duì)濱?；页蓖良?xì)菌豐度的影響

圖4 施用有機(jī)肥對(duì)濱海灰潮土真菌豐度的影響

可以看出，施用有機(jī)肥并不是對(duì)所有微生物都是有利的。雖然有機(jī)肥為土壤微生物提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)，但是在土壤環(huán)境的局限下土壤微生物之間存在競(jìng)爭(zhēng)，有機(jī)肥的施用更有利于腐生型微生物的繁殖[6]，而對(duì)于寄生型微生物則會(huì)起到抑制作用。

2.2.3 真菌的FunGuild功能分類(lèi)統(tǒng)計(jì)

對(duì)各組處理真菌的OTU檢測(cè)值在FunGuild上進(jìn)行檢索分析，結(jié)果如表4所示。連續(xù)3 a施用有機(jī)肥后，各處理土壤中3類(lèi)營(yíng)養(yǎng)型的真菌OTU數(shù)值變化并不一致，從總體趨勢(shì)上看，施用有機(jī)肥更有利于腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌的生長(zhǎng)，其次是共生營(yíng)養(yǎng)型，再次為病理營(yíng)養(yǎng)型。因此，連續(xù)多年施用有機(jī)肥料，既有利于各類(lèi)營(yíng)養(yǎng)型真菌的富集，但也存在加劇土傳病害的風(fēng)險(xiǎn)。

表4 施用有機(jī)肥對(duì)濱?；页蓖镣寥?真菌FunGuild分類(lèi)的影響

3 小結(jié)與討論

水旱輪作與施用商品有機(jī)肥均能增加土壤微生物物種的豐富度，也能引起土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)的變化。本研究基于3 a定位試驗(yàn)，通過(guò)微生物高通量測(cè)序技術(shù)初步明確了余姚市濱?；页蓖镣寥牢⑸锓N群群落結(jié)構(gòu)變化。試驗(yàn)結(jié)果表明，輪作和施用有機(jī)肥均增加了土壤中細(xì)菌、真菌的豐度。在輪作條件下，真菌種群變化較細(xì)菌更多。在輪作時(shí)要關(guān)注土壤水分變化，在水旱輪作與旱旱輪作的比較中，土壤水分變化不僅影響光異養(yǎng)型細(xì)菌生長(zhǎng)，還對(duì)好氧細(xì)菌和腐生型細(xì)菌有抑制作用。真菌較細(xì)菌對(duì)水分的變化更敏感。水旱輪作條件下：當(dāng)種植水稻時(shí)，腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌增加，而共生營(yíng)養(yǎng)型真菌被抑制；當(dāng)種植旱地作物時(shí)，情況則迅速改變。此外，連續(xù)多年施用商品有機(jī)肥有利于腐生型微生物的繁殖生長(zhǎng)。