陳國(guó)，許秀琴

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315101)

病毒感染威脅人類和動(dòng)物健康。養(yǎng)殖戶為避免病毒感染引發(fā)畜禽死亡而造成經(jīng)濟(jì)損失，就將金剛烷胺、金剛乙胺、利巴韋林、嗎啉胍、阿昔洛韋、咪喹莫特、美金剛等抗病毒類藥物摻入飼料中[1-3]。但是，將人類藥物移植獸用，會(huì)造成動(dòng)物中毒、藥物殘留、病毒抑制或變異等不良反應(yīng)，同時(shí)畜禽體內(nèi)不同程度的藥物殘留也會(huì)隨食物鏈遷移而影響人類身體健康。因此，開(kāi)展禽肉中抗病毒藥物多殘留的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法研究，建立準(zhǔn)確性好、靈敏度高、快捷簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法尤為重要[4-9]。為此，特開(kāi)展試驗(yàn)研究，并總結(jié)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

主要儀器包括：Waters 2695 XevoTMTQ MS液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Waters)，Quintix 124電子天平(德國(guó)Sartorius)，N-EVAP 112氮吹儀(美國(guó)Organomation)，3K15離心機(jī)(德國(guó)Sigma)，Vortex Genius 3漩渦振蕩器(德國(guó)IKA)。

主要試劑包括乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、甲酸(色譜純)，均購(gòu)于美國(guó)Merck公司。

供試藥物標(biāo)準(zhǔn)品包括金剛烷胺、金剛乙胺、阿昔洛韋、咪喹莫特、嗎啉胍、美金剛、利巴韋林，均購(gòu)于德國(guó)Dr公司。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液制備：精密稱取10 mg標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋成100 μg·mL-1溶液，-18 ℃冰箱中避光保存。

樣品制備：取雞肉樣品進(jìn)行勻漿，充分混勻，制樣過(guò)程中，盡可能防止樣品受到污染或殘留物含量的變化，試樣于-18 ℃冰箱中保存。

1.2 樣品提取與凈化

1.2.1 提取

稱取5 g試樣(精確至0.000 1 g)置于50 mL離心管中，加入15 mL乙腈-1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸溶液(體積比9∶1)，加蓋后超聲提取10 min，再旋渦混勻3 min，低溫條件下9 000 r·min-1離心10 min，取出上清液，再加入10 mL乙腈-1%甲酸溶液提取液，重復(fù)上述步驟，離心后合并上清液至10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度。

1.2.2 凈化

準(zhǔn)確移取5 mL上清液，加入100 mg PSA(乙二胺基-N-丙基)和100 mg C18-ODS(十八烷基-硅膠)，渦旋1 min，5 000 r·min-1離心5 min，移取3.0 mL上清液于10 mL離心管中，在40 ℃條件下用氮吹儀吹至近干，然后準(zhǔn)確加入1 mL 0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸溶液復(fù)溶，渦旋1 min，超聲5 min后過(guò)膜，試液供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測(cè)定。

1.3 基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)

用1.2節(jié)處理后的樣品基質(zhì)溶液將金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛、阿昔洛韋、咪喹莫特、嗎啉胍配制成1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100 μg·L-1的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液，將利巴韋林配制成5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、100 μg·L-1的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液。同時(shí)，用溶劑按前述質(zhì)量濃度配制系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，以系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液和系列標(biāo)準(zhǔn)工作液的曲線斜率比來(lái)評(píng)價(jià)基質(zhì)效益。

1.4 試驗(yàn)條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq反相色譜柱，規(guī)格100 mm×3.0 mm，粒徑1.8 μm。流動(dòng)相：A相為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸溶液，B相為甲醇。梯度淋洗，流速0.3 mL·min-1，進(jìn)樣體積10 μL。程序如下：0 min，流動(dòng)相A 99%(體積分?jǐn)?shù)，下同)，流動(dòng)相B 1%；2.5 min，流動(dòng)相A 99%，流動(dòng)相B 1%；4.0 min，流動(dòng)相A 85%，流動(dòng)相B 15%；7.0 min，流動(dòng)相A 10%，流動(dòng)相B 90%；7.1 min，流動(dòng)相A 99%，流動(dòng)相B 1%；10.0 min，流動(dòng)相A 99%，流動(dòng)相B 1%。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源，電噴霧正離子模式(ESI+)；監(jiān)測(cè)模式，多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；電噴霧電壓(IS)，3 700 V；離子源溫度(TEM)，500 ℃；錐孔反吹氣流量，25 L·h-1；脫溶劑氣流量，1 000 L·h-1。

供試藥物的質(zhì)譜參數(shù)如下。金剛烷胺，保留時(shí)間7.91 min，定性離子對(duì)152.0/92.7(m/z，下同)，定量離子對(duì)152.0/135.1，駐留時(shí)間100 min，錐孔電壓32 V，碰撞電壓26 V(定性)、14 V(定量)；金剛乙胺，保留時(shí)間8.57 min，定性離子對(duì)180.1/121.2，定量離子對(duì)180.1/163.3，駐留時(shí)間100 min，錐孔電壓32 V，碰撞電壓24 V(定性)、15 V(定量)；美金剛，保留時(shí)間8.75 min，定性離子對(duì)180.1/106.7，定量離子對(duì)180.1/163.3，駐留時(shí)間100 min，錐孔電壓32 V，碰撞電壓24 V(定性)、15 V(定量)；阿昔洛韋，保留時(shí)間7.10 min，定性離子對(duì)226.0/134.7，定量離子對(duì)226.0/151.8，駐留時(shí)間100 min，錐孔電壓16 V，碰撞電壓26 V(定性)、10 V(定量)；咪喹莫特，保留時(shí)間8.60 min，定性離子對(duì)241.1/113.7，定量離子對(duì)241.1/184.9，駐留時(shí)間100 min，錐孔電壓66 V，碰撞電壓54 V(定性)、22 V(定量)；嗎啉胍，保留時(shí)間2.68 min，定性離子對(duì)172.0/112.7，定量離子對(duì)172.0/59.6，駐留時(shí)間100 min，錐孔電壓28 V，碰撞電壓16 V(定性)、18 V(定量)；利巴韋林，保留時(shí)間2.97 min，定性離子對(duì)245.0/95.6，定量離子對(duì)245.0/112.6，駐留時(shí)間100 min，錐孔電壓18 V，碰撞電壓28 V(定性)、8 V(定量)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)效應(yīng)

通過(guò)基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)，分別擬合7種抗病毒藥物系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液和系列標(biāo)準(zhǔn)工作液的標(biāo)準(zhǔn)曲線(表1)，其決定系數(shù)(R2)均大于0.999。金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛、咪喹莫特、利巴韋林的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(即由系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線)和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線(即由系列標(biāo)準(zhǔn)工作液擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線)的斜率比在0.85～0.91，說(shuō)明基質(zhì)效應(yīng)不明顯；而阿昔洛韋、嗎啉胍的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率比分別為0.63、0.45，基質(zhì)效應(yīng)明顯。基于此，本試驗(yàn)實(shí)際分析樣品時(shí)均采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。

表1 供試藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 檢測(cè)限、定量限

開(kāi)展空白樣品平行試驗(yàn)，按3倍信噪比計(jì)算方法檢出限，按10倍信噪比計(jì)算方法定量限(表2)。結(jié)果顯示，7種抗病毒藥物的檢出限在2.5×10-4～1.5×10-3mg·kg-1，定量限在0.001～0.005 mg·kg-1。

2.3 準(zhǔn)確度和精密度

表2 供試藥物的定量限和檢出限

方法的準(zhǔn)確度和精密度分別由添加回收率和變異系數(shù)來(lái)表示。在雞肉中按要求添加7種供試藥物，每種濃度重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算添加回收率和變異系數(shù)，評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果如表3所示。金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛、阿昔洛韋、咪喹莫特、嗎啉胍在1.0、5.0、50.0 μg·kg-1的添加水平下，添加回收率在79%～107%；利巴韋林在5.0、10.0、50.0 μg·kg-1的添加水平下，回收率在84%～99%。供試藥物的平行試驗(yàn)組內(nèi)和組間變異系數(shù)均未超過(guò)10%。以上結(jié)果表明，該方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

表3 供試藥物的添加回收率和變異系數(shù)(n=6)

2.4 樣品驗(yàn)證

采用所建立的方法對(duì)10個(gè)雞肉樣品進(jìn)行分析，共檢出陽(yáng)性樣品3個(gè)，均系從樣品中檢出金剛烷胺，含量分別為0.021、0.025、0.031 mg·kg-1，其他供試藥物在各樣品中均未檢出。

3 小結(jié)與討論

3.1 討論

3.1.1 提取條件優(yōu)化

7種供試藥物均屬于極性化合物，易溶于水和一些有機(jī)溶劑，一般選用有機(jī)溶劑-水的混合液進(jìn)行提取。對(duì)比乙腈-水溶液(體積比9∶1)和甲醇-水溶液(體積比9∶1)對(duì)目標(biāo)分析物回收率的影響，發(fā)現(xiàn)乙腈-水溶液的提取效果更好。向乙腈-水溶液中添加一定比例的甲酸，對(duì)回收率的影響不大，但可起到一定的凈化效果，能夠提高方法靈敏度。因此，綜合選擇乙腈-1%甲酸溶液(體積比9∶1)作為提取液。

3.1.2 凈化方式選擇

QuEChERS方法是由分散固相萃取法演變而來(lái)的，樣品經(jīng)有機(jī)溶劑提取、鹽析分層后，再進(jìn)行分散固相萃取，從而達(dá)到凈化目的。本研究采用的PSA和C18-ODS填料，對(duì)樣品中的脂肪、蛋白質(zhì)凈化效果良好，能有效降低基質(zhì)效應(yīng)，提高樣品檢測(cè)靈敏度。QuEChERS方法相較于固相萃取小柱的凈化方式，更快捷、環(huán)保，且成本低廉，有廣闊的應(yīng)用前景。

3.1.3 色譜條件優(yōu)化

色譜中常用的有機(jī)相有甲醇和乙腈。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，若以甲醇作為有機(jī)相，7種供試藥物的響應(yīng)值均有較大提高。另外，向水相中添加甲酸或乙酸銨也能提高目標(biāo)化合物的響應(yīng)值，但是當(dāng)添加乙酸銨時(shí)，金剛乙胺和美金剛的峰形很難分開(kāi)，而添加0.1%甲酸時(shí)，各供試藥物能有效分離，且峰形好。因此，水相采用0.1%甲酸水溶液。

3.2 小結(jié)

本方法選擇乙腈-1%甲酸溶液(體積比9∶1)作為提取液，采用QuEChERS方法，建立起LC-MS/MS分析方法，金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛、阿昔洛韋、咪喹莫特、嗎啉胍、利巴韋林的檢出限在2.5×10-4～1.5×10-3mg·kg-1，定量限在0.001～0.005 mg·kg-1，回收率在79%～107%，平行試驗(yàn)組內(nèi)和組間變異系數(shù)均未超過(guò)10%?？梢?jiàn)，所建立的方法適用于禽肉中抗病毒藥物的多殘留分析。