毛榮良，李英迪，曹艷，黃良水，夏其樂*

(1.常山縣豪鋒農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，浙江 常山 324207； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品采后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021； 3.常山縣天樂食用菌研究所，浙江 常山 324200)

猴頭菇又稱猴頭蘑、猴頭菌、刺猬菌或花菜菌等，屬齒菌科猴頭屬[1]，其營養(yǎng)豐富，味道鮮美，是一種藥食兩用食用菌，素有“山珍猴頭，海味燕窩”之說[2]。猴頭菇性平、味甘，活性成分主要有多肽類、多糖類、多酚類、萜類、甾醇類等，具有益精補(bǔ)虛、抗氧化、抗腫瘤、降血脂、提高免疫力等功效，其子實(shí)體可以用來治療胃潰瘍，慢性胃炎和其他、消化道相關(guān)疾病[3-5]。關(guān)于猴頭菇活性成分的研究中，多糖的研究頗多[6]，其他活性物質(zhì)研究相對(duì)較少。酚類物質(zhì)是主要存在于植物中的次生代謝產(chǎn)物[7]，猴頭菇中酚類物質(zhì)大多以活性酚羥基的形式存在，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可以作為天然的抗氧化劑，也可以經(jīng)過提取富集后進(jìn)一步發(fā)揮其活性。采用乙醇溶液提取猴頭菇中醇溶性小分子成分，如多酚、黃酮等的研究相對(duì)較少[8]。本研究以猴頭菇為原料，利用響應(yīng)面法優(yōu)化猴頭菇多酚提取工藝，為獲得高品質(zhì)的猴頭菇酚類提取物及下游抗氧化產(chǎn)品的開發(fā)提供可靠的手段和一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

猴頭菇，采自常山縣森力家庭農(nóng)場；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，購自上海源葉；福林酚，上海藍(lán)季；乙醇為分析純。

紫外/可見分光光度儀UV-1800，日本島津公司；飛鴿低速大容量離心機(jī)LXJ-HB，上海安亭科學(xué)儀器廠；多功能粉碎機(jī)BJ-300，德清拜杰電器有限公司。

1.2 原料預(yù)處理

將猴頭菇干制品粉碎機(jī)粉碎，密封后置于4 ℃冷藏，備用。

1.3 猴頭菇多酚含量測(cè)定

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

多酚含量采用Folin-Ciocalteu法進(jìn)行測(cè)定[9]。分別吸取0.1 mg·mL-1沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL，置于25 mL比色管中，加入2.5 mL福林酚顯色劑，混勻后加入5 mL 5% Na2CO3溶液，加水定容至25 mL，25 ℃下避光反應(yīng)1 h，于750 nm處測(cè)定吸光度。以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制多酚含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得線性回歸方程。

1.3.2 多酚提取液的制備

在前期預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，為優(yōu)化提取工藝，選擇不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30 g∶mL)、乙醇濃度(40%、60%、80%)、提取溫度(40、60、80 ℃)進(jìn)行提取工藝的優(yōu)化。所得提取液4 000 r·min-1，離心10 min，收集上清液，即猴頭菇多酚提取液。

1.3.3 多酚得率的測(cè)定

取0.3 mL提取液，加9 mL蒸餾水混勻，加入2.5 mL福林酚顯色劑，其余試驗(yàn)操作同標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定，于750 nm處測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)曲方程計(jì)算樣品多酚含量。計(jì)算多酚得率：

M=100CNV/m。

式中，M為猴頭菇多酚得率(mg·g-1)；C為沒食子酸濃度(mg·mL-1)；V為提取液的總體積(mL)；N為稀釋倍數(shù)；m為猴頭菇質(zhì)量(g)。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化猴頭菇多酚的提取工藝

采用Design Expert 10.0.3軟件進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)，確定超聲輔助提取猴頭菇多酚的最佳工藝參數(shù)，中心組合試驗(yàn)因素和水平分別為乙醇濃度為40%、60%、80%，溫度為40 ℃、60 ℃、80 ℃，料液比為1∶10、1∶20、1∶30 (g∶mL)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

平行試驗(yàn)3次，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(means±SD)表示。使用Excel 2007繪圖，采用Design expert 10.0.3軟件得到響應(yīng)面圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)1.3.1標(biāo)曲測(cè)定方法，分別以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，750 nm處吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為Y=0.088 8X-0.001 9，R2=0.999 6。結(jié)果表明，多酚含量在0～7 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化條件

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果分析

為確定最優(yōu)條件，探究各因素之間的相互作用，通過Box-Behnken法設(shè)計(jì)試驗(yàn)[10]，以多酚得率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法對(duì)猴頭菇干制品的酚類化合物進(jìn)行提取工藝的優(yōu)化。與傳統(tǒng)的多因素單變量優(yōu)化試驗(yàn)相比，響應(yīng)曲面法可以研究各因素之間的相互作用，具有試驗(yàn)次數(shù)少、省時(shí)省力、精確等優(yōu)點(diǎn)[11]。

對(duì)表1試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到多酚得率的二次多項(xiàng)回歸模型為：

其中，Y為多酚得率的預(yù)測(cè)響應(yīng)值，X1為乙醇濃度(%)的編碼值，X2為溫度(℃)的編碼值，X3為料液比(g∶mL)的編碼值。

表1 猴頭菇酚類提取試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面模型建立及顯著性分析

表2 酚類化合物提取回歸模型方差分析

2.3 酚類化合物提取工藝的響應(yīng)曲面分析、最佳工藝參數(shù)確定

圖1、2、3顯示了不同試驗(yàn)因素(乙醇濃度、溫度以及液料比)對(duì)于猴頭菇酚類化合物提取的影響。從圖可以看出，響應(yīng)值Y隨試驗(yàn)因素變化均先增高而后降低，在試驗(yàn)水平范圍內(nèi)出現(xiàn)一個(gè)最高點(diǎn)，即為多酚得率較高點(diǎn)。由Design expert 10.0.3軟件分析結(jié)果可知，猴頭菇酚類化合物超聲波輔助提取的最佳工藝參數(shù)為乙醇濃度60.38%，溫度55.46 ℃，料液比1∶15.59(g∶mL)。工藝參數(shù)預(yù)測(cè)的多酚得率為16.799 mg·g-1。為了操作方便，將最佳工藝參數(shù)設(shè)定為乙醇濃度60%，溫度55 ℃，料液比1∶15(g∶mL)。為檢驗(yàn)響應(yīng)面分析法可靠性，3次重復(fù)試驗(yàn)的提取得率為16.701 mg·g-1，與預(yù)測(cè)值較為接近，表明該模型對(duì)猴頭菇酚類化合物的提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

圖1 提取溫度與料液比對(duì)猴頭菇多酚得率影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖

圖2 乙醇濃度與料液比對(duì)猴頭菇多酚得率影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖

圖3 乙醇濃度與提取溫度對(duì)猴頭菇多酚得率影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖

3 小結(jié)

本研究通過乙醇濃度、提取溫度、料液比3個(gè)影響因素對(duì)猴頭菇多酚的提取進(jìn)行研究，通過Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，最終確定最佳提取工藝條件為乙醇濃度60%，溫度55 ℃，料液比1∶15 (g∶mL)，在此條件下，多酚得率相對(duì)較高。驗(yàn)證試驗(yàn)顯示，猴頭菇多酚得率為16.701 mg·g-1，與預(yù)測(cè)值接近，說明響應(yīng)曲面法建立的模型準(zhǔn)確可靠，能合理優(yōu)化猴頭菇多酚的提取工藝。