榮雪路，丁國偉，魏榮榮，李琛，李甜甜

(揚州優(yōu)邦生物藥品有限公司，江蘇 揚州 225000)

雞新城疫(newcastle disease，ND)、禽流感(avian influenza)、傳染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)是嚴重危害家禽養(yǎng)殖業(yè)的傳染病，主要預(yù)防措施是疫苗免疫[1]。為了有效控制疾病的發(fā)生，減少免疫應(yīng)激和免疫次數(shù)，多聯(lián)苗成了養(yǎng)殖業(yè)需求的新產(chǎn)品之一。隨著新流(ND+H9)二聯(lián)苗的成功研制和應(yīng)用，更多不同種抗原聯(lián)合疫苗成為眾多實驗室研究對象[2]。目前，新城疫-禽流感-法氏囊三聯(lián)疫苗(簡稱“新流法三聯(lián)苗”)成為我國養(yǎng)殖業(yè)需求的疫苗新產(chǎn)品之一。

雞傳染性法氏囊病(infectious bursal disease，IBD)是由雞傳染性法氏囊病毒(infectious bursal disease Virus，IBDV)感染引發(fā)的雞高度接觸性免疫抑制類疾病[3]。IBDV屬于雙股雙節(jié)段RNA病毒科，無囊膜，其毒株包括經(jīng)典毒株(classic IBDV，cIBDV)、變異毒株(variant IBDV，vIBDV)、超強毒株(very virulent IBDV，vvIBDV)[4]。IBD主要危害3～6周齡雛雞，是一種急性、致死性、高度接觸性傳染病，傳播途徑為消化道和呼吸道，病雞精神萎靡、蹲伏、排黃白色黏稠和水樣稀糞，極度虛弱，最后死亡，剖檢可見法氏囊腫大、出血、萎縮或呈膠凍樣，嚴重的可出現(xiàn)紫葡萄樣，腿肌、胸肌出血等。傳染性法氏囊抗原制備的原始方法是由雞胚成纖維細胞制備，其病毒含量很低[5]，安全性較差，且疫苗成本較高。隨著疫苗研制方法的不斷提升和基因工程苗的出現(xiàn)，重組病毒蛋白成為疫苗中理想的可替代抗原，其制備簡單、安全穩(wěn)定、成本較低。本文在新流法三聯(lián)疫苗中法氏囊部分用重組雞傳染性法氏囊病毒VP2蛋白作為抗原，并對免疫后雞群的抗體水平及效力檢驗進行研究，為該疫苗提供免疫效果評價。

1 材料與方法

1.1 材料

雞傳染性法氏囊病毒強毒BC6/85株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，新流法三聯(lián)苗由揚州優(yōu)邦生物藥品有限公司提供。SPF雞種蛋購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司，在本實驗室孵化飼養(yǎng)到所需日齡。

1.2 方法

1.2.1 新流法三聯(lián)苗免疫后ND/H9/IBDV抗體水平檢測及IBDV部分效力檢驗

50羽21日齡SPF雞均分為5組，進行頸部皮下免疫，1組為對照組，2組免疫劑量0.05 mL，3組免疫劑量0.1 mL，4組免疫劑量0.2 mL，5組免疫劑量0.3 mL。免疫后第21天采血，參考文獻[6]，分別檢測ND/H9 HI抗體及IBD AGP抗體，并進行雞IBDV強毒BC6/85株F1代攻毒，每只點眼0.1 mL(病毒含量100 BID)，觀察96 h后全部剖檢，檢查法氏囊病變情況。試驗雞在SPF雞隔離器中飼養(yǎng)，自由采食飲水。

1.2.2 雞傳染性法氏囊病毒強毒BC6/85株BID測定

25羽30日齡SPF雞均分為5組，進行攻毒，每只點眼0.1 mL。處理分別為：1組為對照組，2組病毒稀釋度為10-2，3組病毒稀釋度為10-3，4組病毒稀釋度為10-4，5組病毒稀釋度為10-5。試驗雞在SPF雞隔離器中飼養(yǎng)，自由采食飲水。試驗持續(xù)96 h。

1.2.3 AGP法檢測血清中IBDV抗體水平

將30 μL抗原放入制備好的梅花型雙向擴散瓊脂板的中心孔，血清以2的稀釋倍數(shù)稀釋至5，按稀釋倍數(shù)0～5依次放入梅花型外圍孔，每孔各30 μL，做好標記，放入濕盒內(nèi)24～48 h之間，在強光下觀察并記錄中間孔(抗原)和周邊孔(抗體)之間出現(xiàn)免疫復(fù)合沉淀線的數(shù)值(數(shù)值為2稀釋倍數(shù))。

1.2.4 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 新流法三聯(lián)苗免疫后ND/H9部分抗體檢測

由表1可知，新流法三聯(lián)疫苗免疫后21 d，0.3 mL免疫劑量組ND抗體水平為8.1log 2，H9抗體水平為9.0log 2，說明重組雞傳染性法氏囊病毒VP2蛋白作為抗原在疫苗中不影響ND和H9部分的免疫效果。

表1 新流法三聯(lián)疫苗免疫ND及H9抗體水平

2.2 新流法三聯(lián)苗免疫后IBDV部分抗體檢測

由表2可知，試驗組和對照組相比差異顯著(P<0.05)，5組和2組差異顯著。

表2 法氏囊疫苗免疫后抗體水平

2.3 雞傳染性法氏囊病毒強毒BC6/85株BID測定

將雞傳染性法氏囊病毒強毒BC6/85株從10-1稀釋至10-5，對42日齡SPF雞進行攻毒，每個稀釋度重復(fù)5只，觀察96 h，剖檢記錄各稀釋度出現(xiàn)病變動物的百分比(表3、圖1)，測得BID為102.0·(0.1 mL)-1。

表3 雞傳染性法氏囊病毒強毒BC6/85株測定結(jié)果

A—正常的法氏囊；B—紫葡萄樣法氏囊；C—膠凍樣法氏囊；D—膠凍樣法氏囊剖開內(nèi)有出血點。圖1 法氏囊病變的觀察結(jié)果

將雞傳染性法氏囊病毒強毒BC6/85株BID測定的試驗動物中，取發(fā)病的法氏囊制備研磨液獲取雞傳染性法氏囊病毒強毒BC6/85株F1代病毒，測得BID為104.0·(0.1 mL)-1(表4)。

表4 雞傳染性法氏囊病毒強毒BC6/85株F1代測定結(jié)果

2.4 效力檢驗(免疫攻毒保護)

攻毒對照全部發(fā)病，法氏囊外觀發(fā)黃，呈膠凍樣外觀。囊內(nèi)剖開有黏液，部分肉眼可見出血。未攻毒對照和免疫組，外觀正常，剖開未見病變，免疫攻毒保護率為100%(圖2)。

A—未攻毒對照組；B—攻毒未免疫組；C—免疫0.05 mL組；D—免疫0.1 mL組；E—免疫0.2 mL組；F—免疫0.3 mL組。圖2 各組法氏囊的變化

3 討論

在家禽養(yǎng)殖業(yè)中防治各大傳染病的有效方法之一就是進行免疫。但是隨著病毒病毒株的不斷變異，傳統(tǒng)疫苗對于疾病的防控效果變得越來越差。比如IBDV在未出現(xiàn)變異株之前，傳統(tǒng)疫苗的經(jīng)典株可以使IBD得到有效控制，但是變異株的出現(xiàn)，特別是超強毒株的出現(xiàn)，疫苗經(jīng)典株的免疫失敗屢見不鮮[7]。因此，了解IBDV分子變化，制備基因重組蛋白抗原，對該病的防控具有重要意義。IBDV的主要結(jié)構(gòu)和功能蛋白VP2約占病毒總蛋白的51%[8]。IBDV的毒力分子基礎(chǔ)和致病性分子標志主要在VP2上已經(jīng)被國內(nèi)外學者廣泛研究并證實[9]，因此，VP2蛋白成為近年來IBDV新型亞單位疫苗研究的熱點。

雞新城疫(newcastle disease，ND)、禽流感(avian influenza)二聯(lián)苗的成功研制和推廣，從實踐角度真正做到了減少免疫應(yīng)激和次數(shù)，滿足了市場需求，實現(xiàn)了一針多防的防疫效果，同時為多聯(lián)苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

獸藥管理條例及新獸藥申報規(guī)程中，用于防疫這3種傳染病的疫苗免疫后校驗標準為新城疫免疫后3～4周，對照組雞血清HI抗體水不高于1∶4，免疫雞血清HI抗體水平不低于1∶16；禽流感免疫后3～4周，對照組雞血清HI抗體水不高于1∶4，免疫雞血清HI抗體水平不低于1∶128；法氏囊免疫后3～4周，對照組雞血清瓊擴效價均應(yīng)為陰性，免疫雞血清瓊擴效價不低于1∶8。從免疫后各部分抗體水平分析，該疫苗3種抗原免疫效果均達到規(guī)定要求，免疫效果良好。3種抗原混合使用并不相互影響免疫效果。由于攻毒毒株雞傳染性法氏囊病毒強毒BC6/85株放置時間較長，為了保證其毒力，進行復(fù)壯傳代一次，最終確認攻毒病毒BID為104.0·(0.1 mL)-1。攻毒后，剖檢攻毒對照組均發(fā)病，法氏囊外觀呈黃色膠凍樣，剪開囊內(nèi)有黏液，且有不同程度出血。各免疫組和未攻毒對照組相同，外觀正常，囊內(nèi)無肉眼可見病變，說明免疫組免疫后產(chǎn)生抗體可以保護病毒感染，該疫苗免疫后法氏囊病毒攻毒保護率為100%，符合獸藥典要求。因此，雞傳染性法氏囊病毒VP2蛋白應(yīng)用于多聯(lián)疫苗中免疫劑量達到0.05 mL時，具有良好的免疫保護效力，且不影響疫苗中其他抗原的免疫效果。綜上所述，重組雞傳染性法氏囊病毒VP2蛋白應(yīng)用于多聯(lián)疫苗中免疫效果良好。