許凱倫，馬建忠，胡園，徐匯鑌，王芳，鄭伊諾，吳越

(浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所，浙江 溫州 325005)

哈維氏弧菌是石斑魚(Epinephelusspp.)養(yǎng)殖過程中主要的致病菌之一，可引起石斑魚的皮膚潰瘍癥、突眼癥[1-3]，嚴重影響了養(yǎng)殖效益。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，藥物防治仍然是控制哈維氏弧菌最直接有效的手段。噁喹酸作為一種水產(chǎn)專用抗菌類藥物，具有廣譜、高效、低毒的特點，是水產(chǎn)專用抗菌類藥物。已有學者對噁喹酸在大西洋庸鰈(Hippog-lossushippoglossus)、歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)和凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)等[4-6]多種水產(chǎn)品中的代謝規(guī)律進行研究。噁喹酸在水產(chǎn)動物中的基礎代謝已有較多報道，但多是在健康動物中進行研究，而在患病動物中的臨床藥代謝研究很少。本文通過構建石斑魚哈維氏弧菌人工感染模型，比較噁喹酸在健康和感染哈維氏弧菌石斑魚體內(nèi)的藥代動力學特征，并結合哈維氏弧菌對噁喹酸的體外藥敏實驗，以期為噁喹酸在水產(chǎn)臨床的應用制定科學合理的給藥方案提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗石斑魚及菌株

健康石斑魚體重為(500±50)g，于浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所洞頭基地養(yǎng)殖，養(yǎng)殖水溫為(25±3)℃。隨機抽取該基地的石斑魚進行檢測，未發(fā)現(xiàn)噁喹酸存在，養(yǎng)殖期間所投喂飼料均不含噁喹酸。

1.2 實驗菌株

11株哈維氏弧菌H1～H11，由本單位自溫州地區(qū)發(fā)生病害的養(yǎng)殖海水魚類、蝦類和貝類體內(nèi)分離保存，均已做過生化鑒定和16S rRNA測序。

1.3 哈維氏弧菌人工感染石斑魚

石斑魚的哈維氏弧菌侵染和半致死劑量實驗參考林克冰等[7]的方法，將菌株接種于2216E培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)18～24 h，用無菌生理鹽水稀釋得到濃度為2×109mL-1的哈維氏弧菌混懸液，備用。將混懸液和生理鹽水以1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32的比例梯度配制侵染液進行腹腔注射感染，健康組注射無菌生理鹽水。本實驗設置2次生物學重復，每次重復選取5尾石斑魚，每尾石斑魚的注射量為0.3 mL。各處理組石斑魚連續(xù)觀察2周，記錄死亡情況。

1.4 LD50的測定和細菌分離

LD50的測定參照Reed-Muench[8]的方法，計算公式為：lg LD50=algb+c；a為距離比例，a=(高于50%死亡率-50%)/(高于50%死亡率-低于50%死亡率)；b為稀釋系數(shù)，本實驗的稀釋系數(shù)為2-1；c為高于50%死亡率的最小濃度的對數(shù)。選擇人工感染后瀕死且有典型癥狀的石斑魚進行病原菌的分離鑒定，于超凈臺上用無菌接種環(huán)挑發(fā)病組織接種于硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(TCBS)上在28 ℃下分離培養(yǎng)12 h，挑取形態(tài)、色澤較一致的優(yōu)勢菌落劃線進行純化培養(yǎng)3次。挑取純化后的單菌落接種于2216E液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)過夜，檢索《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》進行菌株生理生化鑒定，所用的生化鑒定試劑購買自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.5 石斑魚給藥

以LD50哈維氏弧菌混懸液腹腔注射石斑魚，待魚體有明顯癥狀時肌肉注射噁喹酸作為感染組，另設健康石斑魚作為對照組。噁喹酸注射用藥液的配制參考梁增輝[9]的方法，稱取噁喹酸1.500 g，溶解于0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液，用6 mol·L-1鹽酸調節(jié)pH至10.5，用0.9%氯化鈉水溶液定容至100 mL，配制成終濃度為15 g·L-1的注射用藥液，以20 mg·kg-1魚體重進行肌肉注射給藥。

1.6 藥動學研究

1.6.1 樣本收集

分別取給藥后0、0.5、1、2、4、8、12、24、48、72和96 h的健康組和感染組石斑魚各3尾采集尾靜脈血于含有1%肝素鈉的離心管中，離心分離血漿并于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 血漿中噁喹酸的測定

血樣前處理參考王慧[10]的方法，取樣品1 mL于25 mL離心管中，加入乙酸乙酯20 mL，無水硫酸鈉1 g，超聲提取5 min。3 000 r·min-1離心10 min后，上清液轉入50 mL茄形瓶中。于50～55 ℃下旋轉蒸發(fā)至近干，迅速加入1 mL流動相溶解，再加入1 mL正己烷于漩渦混合器上充分振蕩，轉入5 mL離心管中，3 000 r·min-1離心5 min，取下層清液，用0.22 μmol·L-1的針式濾器過濾至進樣瓶中。用高效液相色譜法測定噁喹酸在各樣本中的游離藥物濃度，具體色譜條件如下：色譜柱：安捷倫C18；流動相：1%甲酸水溶液-乙腈(70+30)；流速：1.0 mL·min-1；檢測器波長：激發(fā)波長312 nm，發(fā)射波長366 nm;進樣量50 μL。

1.6.3 數(shù)據(jù)處理

健康組和感染組石斑魚血漿中噁喹酸的藥時數(shù)據(jù)使用藥代動力學軟件winNonln 5.2.1進行房室模型擬合并計算藥動學參數(shù)，藥時曲線用Excel 2013繪制。

1.7 藥敏分析

藥敏實驗操作參考吳立婷等[11]實驗方法，挑取單菌落接種到水解酪蛋白培養(yǎng)基中，于35 ℃振蕩培養(yǎng)6～8 h。將新鮮菌液濃度用無菌生理鹽水調至1×108～2×108mL-1。按照培養(yǎng)基、藥物、菌液的步驟依次加入96孔板中，分別設置128～0.125 mg·L-1的實驗組，細菌對照組和空白對照組，35 ℃培養(yǎng)16～20 h，實驗質控菌為大腸桿菌ATCC 25922。

2 結果與分析

2.1 LD50測定和新菌株的分離

石斑魚人工感染哈維氏弧菌H11后，癥狀為游動緩慢、無力側臥，體表、魚鰭有潰瘍，下頜充血，死魚解剖后發(fā)現(xiàn)脾臟呈現(xiàn)暗紫色，肝臟腫大充血。最高濃度組石斑魚在感染后第2天開始出現(xiàn)死亡，到第4天全部死亡；最低濃度感染組石斑魚在第2天開始表現(xiàn)出發(fā)病癥狀；注射生理鹽水的對照組表現(xiàn)正常。石斑魚死亡率統(tǒng)計結果如表1所示。在1∶2的稀釋比例下，石斑魚累計死亡數(shù)為100%，而高于50%死亡率的最小稀釋比例為1∶8。計算結果表明，哈維氏弧菌腹腔注射感染對石斑魚的LD50為1.2×105g-1魚體重。從感染后的石斑魚中再次分離到一株優(yōu)勢細菌，其菌落狀態(tài)及生化鑒定結果為哈維氏弧菌。

表1 注射不同生理鹽水稀釋比例石斑魚的死亡率

對感染后的石斑魚進行致病菌分離鑒定，得到一株優(yōu)勢細菌，在TCBS培養(yǎng)基上呈現(xiàn)為黃色圓形菌落，表面光滑，中心略凸起，革蘭氏染色陰性，生化鑒定結果為：VP(-)、明膠液化(+)、木糖(-)、甘露醇(+)、鼠李糖(-)、肌醇(-)、淀粉酶(+)、硝酸鹽還原(+)，結果與哈維氏弧菌一致。

2.2 噁喹酸在石斑魚體內(nèi)的代謝

分別對健康組和感染組石斑魚在噁喹酸給藥后各時間點采集血液樣品，使用高效液相色譜檢測血漿中噁喹酸濃度并擬合藥時曲線。結果表明，噁喹酸在健康組和感染組石斑魚血漿中的濃度均呈現(xiàn)先升高后降低的規(guī)律，在健康組中給藥后0.5 h血藥濃度達到峰值，而在感染組中給藥后1 h達到峰值，之后均呈下降趨勢。在0.5和24 h健康組的血藥濃度極顯著高于感染組,4、8、12和96 h健康組的血藥濃度也顯著高于感染組，而1、2、48和72 h健康組與感染組血藥濃度組間差異不顯著(圖1)。總體而言，健康組的血藥濃度高于感染組的血藥濃度。

圖1 健康組和感染組石斑魚血漿中噁喹酸的藥時曲線

將健康組和感染組石斑魚血漿中噁喹酸的藥時數(shù)據(jù)通過藥代動力學軟件winNonln 5.2.1進行房室模型擬合，結果發(fā)現(xiàn),健康組和感染組石斑魚血漿中噁喹酸的藥時數(shù)據(jù)均符合一級吸收二室模型，藥動學方程分別為：C=2 739.980e-2.545t+9.039e-0.026t-2 749.019e-0.270t；C=1 297.339e-0.745t+4.058 5e-0.013t-1 301.397e-0.921t。

噁喹酸在血漿中藥動學參數(shù)如表2所示，感染組的達峰濃度低于健康組，達峰時間比健康組延后，血藥濃度時間線下面積小于健康組但兩組間的差異不明顯，消除半衰期長于健康組。

表2 各組別石斑魚血漿中的藥動學參數(shù)

2.3 哈維氏弧菌對噁喹酸的敏感性

11株哈維氏弧菌對噁喹酸的藥敏實驗結果顯示,11株哈維氏弧菌對噁喹酸敏感性存在一定差異，但整體而言其最小抑菌濃度(MIC)值較低。其中，H4菌株的MIC值為0.5 mol·L-1；H2、H3、H5、H10和H11菌株的MIC值為1 mol·L-1；H1、H6、H7、H8和H9菌株的MIC值為2 mol·L-1。

3 小結與討論

本研究中11株哈維氏弧菌對噁喹酸的MIC值為0.5～2 mg·L-1，與王元等[12]分析的35株哈維氏弧菌對噁喹酸的MIC值主要為0.15～2.5 μg·mL-1的結果相符合。研究表明，噁喹酸對引發(fā)海水養(yǎng)殖病害的溶藻膠弧菌、哈維氏弧菌、坎貝氏弧菌、副溶血弧菌等弧菌有明顯的抑制效果，對淡水養(yǎng)殖致病菌嗜水氣單胞菌也具有較明顯的抑制效果[13]。因此，可以考慮將噁喹酸作為防治石斑魚哈維氏弧菌感染的抗菌藥。

抗菌藥物臨床動力學的研究過程中感染模型的建立至關重要。本實驗基于Reed-Muench法分析[8]哈維氏弧菌對石斑魚的LD50為1.2×105g-1魚體重。陳獻稿等[14]以腹腔注射法分析了哈維氏弧菌對石斑魚的LD50，其結果為2.7×106g-1，林克冰[7]等通過肌肉注射、腹腔注射和創(chuàng)傷浸浴3種方式進行哈維氏弧菌感染實驗，得到3種方式下哈維氏弧菌對石斑魚的LD50分別為4.3×104、2.9×105和5.4×106g-1魚體重。以上研究結果與本實驗結果有所不同，可能是由于哈維氏弧菌株、感染劑量和感染方式的不同引起的。本實驗以1.2×105g-1劑量進行腹腔注射感染，可以獲得較為典型的感染癥狀，又沒有引起快速死亡，符合人工感染模型的要求。

比較健康組和感染組石斑魚體內(nèi)噁喹酸藥代動力學特征發(fā)現(xiàn)，哈維氏弧菌感染導致血藥達峰時間延遲，達峰濃度降低，消除半衰期變長，血藥濃度時間線下面積變小。這與劉彥等[15]比較達氟沙星在健康和鰻弧菌感染牙鲆體內(nèi)的藥物代謝動力學的結果一致。哈維氏弧菌感染后血藥濃度時間線下面積和達峰濃度比健康組明顯降低，達峰時間也有所推遲，這表明哈維氏弧菌感染會引起機體對藥物的吸收能力下降，而消除半衰期變長表明感染會影響機體對藥物的代謝能力。石斑魚感染后藥動學參數(shù)的改變可能是由于疾病影響了機體正常的生理、生化機能和器官功能狀態(tài)，從而使藥物的吸收、分布和代謝等均發(fā)生了變化。因此,在制定臨床給藥方案時，需要充分考慮疾病因素對藥物量效關系的影響。噁喹酸是濃度依賴型的喹諾酮藥物，研究表明Cmax/MIC和AUC0-24/MIC值是評價其療效的關鍵指標，當AUC24/MIC≥100或Cmax/MIC>8時可獲得理想的臨床療效[16-17]。在本實驗中，感染條件下血藥達峰濃度Cmax為11.32 mg·L-1，MIC為1 mg·L-1，Cmax/MIC>8，因此在感染情況下，可以采用20 mg·kg-1的體質量給藥方案。