焦云，鄔玉芬，舒巧云

(寧波市農(nóng)業(yè)科學研究院 林業(yè)研究所，浙江 寧波 315040)

榧樹(Torreyagrandis)通常為雌雄異株，鮮有雌雄同株，群體內(nèi)變異復(fù)雜，籽形各異。其中，浙江紹興、諸暨、嵊州等地的榧樹多樣性較為豐富，主要有細榧、珍珠榧、茄榧、象牙榧等[1-2]。

簡單序列重復(fù)(simple sequence repeat，SSR)，又稱微衛(wèi)星序列，是廣泛存在于真核生物基因組中的遺傳標記，具有檢測效率高、技術(shù)難度低、實驗成本低等優(yōu)點，目前已廣泛應(yīng)用于中國李[3]、核桃[4]、棗[5]等林木遺傳多樣性分析和指紋圖譜的繪制。本研究基于榧樹基因組DNA序列篩選出SSR位點分析并設(shè)計引物，然后合成部分引物并從中篩選出擴增條帶清晰，且多態(tài)性高的引物組合，為榧樹遺傳多樣性分析、品種指紋圖譜構(gòu)建和分子標記輔助選擇育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

基因組數(shù)據(jù)為課題組前期從頭測序所得，測序樣品為采集于浙江寧海的香榧葉片，測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。于2020年4月5日采集香榧植株嫩葉，使用Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒(上海，生工生物工程股份有限公司)提取基因組DNA存于-80 ℃冰箱備用。于浙江嵊州采集2020-19、2020-29、2020-32、2020-34、珍珠榧、細榧和茄榧樣品，其中2020-19為雌雄同株，其余均為雄株。于浙江寧波采集2020-44、2020-68和2020-69樣品，均為雄株。

1.2 方法

將香榧基因組從頭測序結(jié)果進行質(zhì)控，過濾質(zhì)量值低于30的堿基，利用CLC Genomics Workbench 12.0(QIAGEN，https://www.qiagen.com)軟件拼接組裝基因組DNA序列，然后使用MISA和Primer 3.0(https://webblast.ipk-gatersleben.de/misa/)腳本對上述序列中SSR位點進行篩選并設(shè)計相應(yīng)的引物；選擇其中擴增產(chǎn)物長度在100～300 bp，GC含量在40%～60%，退火溫度58～62 ℃的引物20對，并在其5′端添加熒光基團和M13通用引物序列(TGTAAAACGACGGCCAGT)，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

基于基因組DNA，使用Taq PCR Master Mix試劑盒(上海，生工生物工程股份有限公司)進行PCR擴增；擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后取適量在ABI3730遺傳分析儀上進行基因型分型檢測，檢測后的原始數(shù)據(jù)使用Peak Scanner Software v1.0(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)軟件進行讀數(shù)，只統(tǒng)計長度范圍為100～500 bp的擴增產(chǎn)物片段，然后使用Excel 2010構(gòu)建數(shù)據(jù)矩陣表；利用軟件POPGENE 1.32計算所有引物組合的Shannon信息指數(shù)和有效等位基因數(shù)；基于遺傳相似矩陣[6]，使用非加權(quán)組平均法(UPGMA)及軟件Free Tree 0.9.1.50進行聚類分析，其中bootstrap值設(shè)置為1 000，聚類圖的修改使用軟件Tree view 1.6.6。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物多態(tài)性

使用10個榧樹品種樣品所提取的基因組DNA對SSR引物進行多態(tài)性評價，共擴增出35個條帶，平均每個引物可擴增6個條帶(表1)。此外，平均有效等位基因位點數(shù)量和Shannon信息指數(shù)分別為4.784 8和1.779 2。每個引物組合擴增條帶數(shù)量范圍為4～9；其中，XF2096可擴增出條帶數(shù)量最多，為9個，其有效等位基因位點數(shù)量和Shannon信息指數(shù)分別為7.142 9和2.068 5。

表1 香榧SSR引物組合多態(tài)性信息

2.2 基于SSR分子標記的香榧遺傳多樣性

基于6對SSR引物的分型結(jié)果并采用UPGMA法構(gòu)建10個榧樹品種的遺傳親緣關(guān)系聚類樹(圖1)。當遺傳相似系數(shù)約為0.73時，可將所有試材分為3個組。A組包含有4個榧樹品種，其中包括細榧和茄榧。B組和C組分別包含有3個榧樹品種，其中，B組包括著名榧樹類型珍珠榧和兩個榧樹雄株，意味著它們相近的遺傳背景；而C組均為榧樹雄株。

聚類樹分支置信度計算中bootstrap值設(shè)置為1 000，聚類樹上僅顯示50以上的分支置信度數(shù)值。圖1 基于SSR分子標記分型產(chǎn)生的10份榧樹試材聚類樹

3 小結(jié)與討論

榧樹為我國特有的珍稀樹種之一，其分布范圍廣，遺傳來源地理環(huán)境復(fù)雜，種內(nèi)與種間性狀變異十分復(fù)雜，有許多自然變異類型[2]。其中，香榧是集果用、油用、藥用等為一體的多用途經(jīng)濟樹種，屬于名貴干果。因此，開發(fā)相應(yīng)的分子標記用于探討其遺傳多樣性，種質(zhì)資源保存及優(yōu)異種質(zhì)篩選是當前的研究重點之一。值得注意的是，前期研究報道中榧樹相關(guān)的分子標記主要以AFLP[7]、RAPD[8]、ISSR[9]等為主，其操作過程較為繁瑣、成本較高，相對于上述分子標記類型，SSR分子標記具有成本低、操作簡便和穩(wěn)定性好等優(yōu)點，可作為榧樹群體結(jié)構(gòu)評價和遺傳多樣性分析的首選分子標記類型。