周玉娣， 蔣 為， 周 萍

（諸暨市人民醫(yī)院腎內(nèi)科，浙江諸暨311800）

腎小球上皮細(xì)胞又叫足細(xì)胞，其附著于腎小球基底膜外側(cè)，是腎小球?yàn)V過(guò)功能的最后屏障。近年來(lái)研究顯示，腎小球上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和凋亡除與蛋白尿的發(fā)生有關(guān)外，其在腎小球硬化癥、腎病綜合征以及包括終末期腎病在內(nèi)的多種慢性腎臟疾病進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用［1］。因此，如何有效的保護(hù)腎小球上皮細(xì)胞，減輕其氧化應(yīng)激損傷和凋亡對(duì)腎臟疾病的防治具有重要意義。

黃芩素（scutellarin，SCU）是從中藥黃芩中提取的一種黃酮類活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤及肝臟保護(hù)等多種生物活性。研究顯示SCU 對(duì)糖尿病大鼠具有一定的腎臟保護(hù)作用［2-3］。SCU 預(yù)處理還可減少腎臟炎癥，減緩順鉑引起的腎功能下降［4］。微小RNA-7-5p（microRNA-7-5p，miR-7-5p）是近年發(fā)現(xiàn)的微小RNA（microRNA，miRNA），研究顯示miR-7-5p 在腸上皮屏障損傷和修復(fù)中發(fā)揮重要作用［5］；姜黃素通過(guò)調(diào)控 miR-7-5p 表達(dá)可防止缺血再灌注過(guò)程中的腦損傷和認(rèn)知功能障礙［6］。然而SCU和miR-7-5 能否在腎小球上皮細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)作用尚未可知。本研究采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）干預(yù)人腎小球上皮細(xì)胞（human glomerular epithelial cells，HGEC）建立細(xì)胞損傷模型［7］，探討SCU 對(duì) LPS 誘導(dǎo)的 HGEC 氧化應(yīng)激、凋亡及 miR-7-5p表達(dá)的影響，初步揭示SCU的作用機(jī)制。

材料和方法

1 材料

HGEC 和RPMI-1640 培養(yǎng)液購(gòu)于上?？道噬锛夹g(shù)有限公司；LPS 購(gòu)于Sigma；模擬物陰性對(duì)照（miR-NC）、miR-7-5p模擬物（miR-7-5p mimics）、抑制物陰性對(duì)照（anti-miR-NC）和miR-7-5p 抑制物（antimiR-7-5p）購(gòu)于上海吉瑪制藥有限公司；黃芩素（CAS號(hào)為491-67-8；純度≥98%）購(gòu)于南京清韻生物科技有限公司；LipofectamineTM2000 購(gòu)于Invitrogen；Trizol試劑、RIPA裂解液、CCK-8和Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海碧云天公司；鼠源細(xì)胞周期素 D1（cyclin D1）抗體、鼠源 cleaved caspase-3 抗體、鼠源β-actin 抗體及山羊抗鼠Ⅱ抗購(gòu)于Santa Cruz；丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量檢測(cè)試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性檢測(cè)試劑盒和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Abnova。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 采用RPMI-1640 培養(yǎng)液于37℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HGEC，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。細(xì)胞分組：正常對(duì)照（normal control，NC）組，正常培養(yǎng)的 HGEC；LPS組，采用LPS含量為1.0 mg/L 的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞 24 h；NC+SCU 組，采用 SCU 濃度為 40 μmol/L的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h；LPS+SCU 組，在LPS 組基礎(chǔ)上給予40 μmol/L的SCU；LPS+miR-NC組，轉(zhuǎn)染miR-NC 后進(jìn)行 LPS 處理；LPS+miR-7-5p 組，轉(zhuǎn)染miR-7-5p mimics 后進(jìn)行 LPS 處理；LPS+SCU+antimiR-NC 組，轉(zhuǎn)染 anti-miR-NC 后進(jìn)行 LPS和SCU 處理；LPS+SCU+anti-miR-7-5p 組，轉(zhuǎn)染 anti-miR-7-5p后進(jìn)行LPS 和SCU 處理。參照LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。

2.2 RT-qPCR 檢測(cè)miR-7-5p 的表達(dá)水平 收集按照2.1 實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行處理的各組細(xì)胞，參照Trizol 試劑說(shuō)明書(shū)提取各組細(xì)胞RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280值在1.8～2.0 之間。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，取cDNA 按照SYBR Green Real-time PCR 試劑盒進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，以 U6 為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算 miR-7-5p 的表達(dá)水平。miR-7-5p和U6的引物由北京華大基因公司合成，序列（5'-3'）如下：miR-7-5p 上游引物序列為TGTTGTTTTGTGAT，下游引物序列為GTGCAGGGTCCGAGGT；U6 上游引物序列為CACTGGGTGCGGCAGGT，下游引物序列為TCATCACCGATCGATACGATGA。

2.3 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)期HGEC，胰酶消化后按照每孔1×104cells 密度接種到96 孔板，孵育過(guò)夜后，按照方法2.1 細(xì)胞分組進(jìn)行細(xì)胞干預(yù)處理，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔加入10 μL的CCK8溶液，培養(yǎng)箱孵育4 h，全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處的吸光度（A450），計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活力。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)期HGEC，胰酶消化后按照每孔2×105cells 密度接種到6 孔板，分組和干預(yù)方法同方法2.1，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，胰酶消化細(xì)胞，采用PBS 重懸細(xì)胞制備細(xì)胞密度為1×108/L 的細(xì)胞懸液。取100 μL 細(xì)胞懸液至流式管，分別加入5 μL 的 Annexin V-FITC和5 μL 的 PI，混勻后避光孵育15 min，于1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。

2.5 Western blot 檢測(cè) cyclin D1和cleaved caspase-3的表達(dá)水平 收集按照2.1 分組進(jìn)行干預(yù)處理的各組細(xì)胞，RIPA 裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白。二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測(cè)定各組樣本蛋白含量，調(diào)整蛋白濃度至3 g/L 后水浴鍋煮沸5 min，冷卻至室溫后-80℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?0 μg細(xì)胞蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 分離細(xì)胞蛋白。利用常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜裝置將細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，放于5%的脫脂牛奶中室溫封閉2 h，洗膜緩沖液洗膜3 min，將膜置于已稀釋的Ⅰ抗溶液中室溫條件孵育2 h，洗膜緩沖液洗膜3 次，將膜置于已稀釋的Ⅱ抗溶液中室溫條件孵育1 h，洗膜緩沖液洗膜3次，加入化學(xué)發(fā)光顯色試劑顯色，每組設(shè)置3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，以β-actin 為內(nèi)參照，利用Quantity One 4.40軟件分析cyclin D1 和cleaved caspase-3的表達(dá)水平。

2.6 細(xì)胞內(nèi)MDA 含量和SOD 活性以及細(xì)胞上清液中LDH 活性的測(cè)定 收集按照2.1 分組進(jìn)行干預(yù)處理的各組細(xì)胞，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，在相應(yīng)波長(zhǎng)處測(cè)定各組細(xì)胞吸光度，再換算成MDA 含量、SOD 活性和LDH活性，分析各組細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 黃芩素對(duì)LPS誘導(dǎo)的HGEC活力的影響

與 NC 組比較，LPS 組 HGEC 中 cyclin D1 表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05）；與LPS 組比較，LPS+SCU 組 HGEC 中 cyclin D1 表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞活力顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖1及表1。

Figure 1.Western blot was used to detect cyclin D1 protein expression.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 vs LPS group.圖1 Western blot檢測(cè)cyclin D1蛋白的表達(dá)

表1 黃芩素對(duì)LPS誘導(dǎo)的HGEC活力的影響Table 1.Effect of scutellarin（SCU）on the viability of LPS-induced HGEC（%.Mean±SD. n=9）

2 黃芩素對(duì)LPS誘導(dǎo)的HGEC凋亡率的影響

與 NC 組比較，LPS 組 HGEC 細(xì)胞 cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與 LPS 組比較，LPS+SCU 組 HGEC 中cleaved caspase-3 蛋白的表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖2及表2。

3 黃芩素對(duì)LPS誘導(dǎo)的HGEC氧化應(yīng)激的影響

與NC組比較，LPS組HGEC中MDA含量和上清液中LDH 活性顯著升高，SOD 活性顯著降低（P＜0.05）；與 LPS 組比較，LPS+SCU 組 HGEC 中 MDA 含量和上清液中LDH 活性顯著降低，SOD 活性顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)表3。

4 黃芩素對(duì)miR-7-5p表達(dá)的影響

與 NC 組比較，LPS 組 HGEC 中 miR-7-5p 的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與LPS 組比較，LPS+SCU組HGEC 中miR-7-5p 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)表4。

Figure 2.Effect of scutellarin（SCU）on LPS-induced apoptosis of HGEC.A：flow cytometry was used to detect the apoptosis；B：Western blot was used to detect the protein level of cleaved caspase-3.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 vs NC+SCU group.圖2 黃芩素對(duì)LPS誘導(dǎo)的HGEC凋亡的影響

表2 黃岑素對(duì)LPS誘導(dǎo)的HGEC凋亡率的影響Table 2.The effect of scutellarin on LPS-induced apoptosis of HGEC（%.Mean±SD. n=9）

5 上調(diào) miR-7-5p 對(duì) LPS 誘導(dǎo)的 HGEC 活力、凋亡及氧化應(yīng)激的影響

與 LPS+miR-NC 組 比 較 ，LPS+miR-7-5p 組HGEC 中 miR-7-5p和cyclin D1 蛋白的表達(dá)水平顯著升高，cleaved caspase-3 蛋白的表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞中MDA 含量和上清液中LDH 活性顯著降低，細(xì)胞中SOD 活性顯著升高，細(xì)胞活力顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖3及表5。

表3 黃芩素對(duì)LPS誘導(dǎo)的HGEC中MDA含量和SOD活性及細(xì)胞培養(yǎng)上清液LDH活性的影響Table 3.Effect of scutellarin（SCU）on MDA content and SOD activity in LPS-induced HGEC and LDH activity in cell culture supernatant（Mean±SD. n=9）

6 miR-7-5p 低表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)黃芩素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的HGEC的影響

與LPS+SCU+anti-miR-NC 組比較，LPS+SCU+anti-miR-7-5p 組 HGEC 細(xì) 胞 miR-7-5p和cyclin D1 蛋白的表達(dá)水平顯著降低，cleaved caspase-3 蛋白的表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞中MDA 含量和上清液中LDH活性顯著升高，細(xì)胞中SOD 活性顯著降低，細(xì)胞活力顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖4及表6。

表4 黃芩素對(duì)miR-7-5p表達(dá)的影響Table 4.Effect of scutellarin（SCU）on miR-7-5p expression（Mean±SD. n=9）

討 論

SCU 作為一種天然抗氧化劑，近年來(lái)其在腎臟疾病中的作用受到了研究者的廣泛關(guān)注。研究顯示SCU 可能通過(guò)抑制核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)以及線粒體途徑介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡進(jìn)而對(duì)大鼠缺血再灌注損傷的發(fā)揮保護(hù)作用［8］。SCU 通過(guò)降低腎小管上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡，減輕過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷［9］。此外，SCU 還可促進(jìn)縫隙連接蛋白43 磷酸化表達(dá)，改善大鼠腎臟縫隙連接通訊功能，逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的增殖抑制作用［10］。但目前 SCU 對(duì) LPS 誘導(dǎo)的 HGEC 氧化應(yīng)激損傷和凋亡的影響還未可知。cyclin D1 是細(xì)胞周期調(diào)控關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)增加可促進(jìn)細(xì)胞周期向 S 期轉(zhuǎn)換，促進(jìn)細(xì)胞增殖［11］。caspase-3 的活化是細(xì)胞凋亡發(fā)生的重要標(biāo)志，抑制其表達(dá)和活化可抑制細(xì)胞凋亡［12］。本研究顯示，SCU 作用于 LPS 誘導(dǎo)的HGEC 后，細(xì)胞活力和cyclin D1 蛋白表達(dá)顯著增加，凋亡率和cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)顯著降低，說(shuō)明SCU 可降低LPS 誘導(dǎo)的HGEC 凋亡，促進(jìn)HGEC存活。正常情況下機(jī)體氧化和抗氧化處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，在病理情況，氧自由基產(chǎn)生過(guò)多或機(jī)體抗氧化酶SOD 活性下降，引發(fā)機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷和功能改變［13-15］。本研究顯示，SCU 可提高 LPS 誘導(dǎo)的 HGEC 中 SOD 活性，降低 MDA 含量及LDH 水平。這提示SCU 可降低LPS 誘導(dǎo)的HGEC氧化應(yīng)激損傷和凋亡。與本研究類似，SCU 通過(guò)抗氧化和抗凋亡機(jī)制對(duì)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷和星形膠質(zhì)細(xì)胞糖氧剝奪損傷亦具有保護(hù)作用［16-17］。

miRNA 是一類內(nèi)源性小分子RNA，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生命過(guò)程，其異常表達(dá)在多種腎臟疾病中具有重要作用［18-19］。miR-7-5p 在大鼠心肌缺血再灌注損傷細(xì)胞模型中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-7-5p 表達(dá)可保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺血再灌注誘導(dǎo)的凋亡［20］；miR-7-5p表達(dá)失調(diào)與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展有關(guān)，多氯聯(lián)苯通過(guò)上調(diào)miR-7-5p表達(dá)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成［21］。為進(jìn)一步探討SCU 抑制LPS 誘導(dǎo)的HGEC 氧化應(yīng)激和凋亡的機(jī)制，本研究檢測(cè)LPS 誘導(dǎo)后HGEC 中miR-7-5p 表達(dá)水平，結(jié)果顯示LPS 可抑制HGEC 中miR-7-5p 表達(dá)，而 SCU 可促進(jìn) LPS 誘導(dǎo)的 HGEC 中 miR-7-5p 的表達(dá)，提示SCU 可能通過(guò)調(diào)控miR-7-5p 表達(dá)減輕LPS誘導(dǎo)的HGEC 損傷。然而，目前miR-7-5p 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的HGEC 氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響還尚不清楚。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-7-5p mimics 上調(diào)HGEC 中miR-7-5p表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)的HGEC氧化應(yīng)激和凋亡受到抑制，而下調(diào)miR-7-5p 可降低SCU 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的HGEC 氧化應(yīng)激損傷和凋亡的保護(hù)作用。這進(jìn)一步說(shuō)明SCU 通過(guò)上調(diào)miR-7-5p 來(lái)減輕LPS 誘導(dǎo)的HGEC氧化應(yīng)激損傷和凋亡。

Figure 3.Western blot was used to detect cyclin D1 and cleaved caspase-3 expression.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs LPS+miR-NC group.圖3 Western blot檢測(cè)cyclin D1和cleaved caspase-3表達(dá)

表5 上調(diào)miR-7-5p對(duì)LPS誘導(dǎo)的HGEC的存活率，凋亡率及氧化應(yīng)激的影響Table 5.The effect of up-regulation of miR-7-5p on the viability，apoptotic rate and oxidative stress of LPS-induced HGEC（Mean±SD. n=9）

Figure 4.Western blot was used to detect the expression of cyclin D1 and cleaved caspase-3.MeanSD. n=3.*P＜0.05 vs LPS+SCU+anti-miR-NC group.圖4 Western blot檢測(cè)cyclin D1和cleaved caspase-3表達(dá)

表6 miR-7-5p低表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)黃芩素對(duì)LPS誘導(dǎo)的HGEC的影響Table 6.Low expression of miR-7-5p reversed the effects of scutellarin（SCU）on LPS-induced HGEC（Mean±SD. n=9）

綜上所述，本研究顯示SCU 可減輕LPS 誘導(dǎo)的HGEC氧化應(yīng)激損傷和凋亡，其機(jī)制與調(diào)控miR-7-5p表達(dá)有關(guān)。這為SCU 在防治HGEC 損傷中的應(yīng)用提供了參考資料。