李星星, 張 翔, 黃雪松

暨南大學(xué)理工學(xué)院食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632

引 言

大蒜(AlliumsativumL.，又稱為葫蒜、葫、獨(dú)蒜等)，富含含硫氨基酸，如蒜氨酸(S-allyl cysteine sulfoxid，SACS)、脫氧蒜氨酸(S-allyl cysteine，SAC)、S-烯丙基巰基半胱氨酸(S-allyl mercapto cysteine，SAMC；見圖1)等，它們具有清除自由基、抗糖尿病等多種功效。大蒜的保健、藥用等生物學(xué)功能，應(yīng)當(dāng)同這些含硫氨基酸和存在于生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)等生物大分子之間的相互作用有直接關(guān)系。藥物分子進(jìn)入體內(nèi)后與血清白蛋白結(jié)合，在體內(nèi)被運(yùn)輸、儲(chǔ)存，發(fā)揮藥用價(jià)值，常常以BSA作為模型蛋白闡明研究保健功能成分與血清蛋白之間的結(jié)合方式、結(jié)合位點(diǎn)等相互作用機(jī)制；這些機(jī)制的闡明，對(duì)于保健食品、藥物等產(chǎn)品的開發(fā)與應(yīng)用，具有重要的理論指導(dǎo)價(jià)值。

圖1 三種含硫氨基酸的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of three kinds of sulfur-containing amino acids

馬雪紅[1]報(bào)道了SACS與BSA、HSA的結(jié)合作用，即在298 K下結(jié)合常數(shù)分別為9.81×102和2.27×102L·mol-1；SAC與BSA之間的作用主要為靜電引力，與HSA之間的作用主要為疏水作用力。Sun[2]等報(bào)道了SACS和HAS的結(jié)合作用，在298 K結(jié)合常數(shù)為1.58×104L·mol-1；SAC與BSA之間的作用主要為氫鍵和范德華力。由此可見，這兩種氨基酸因結(jié)構(gòu)不同結(jié)合作用相差較大，而SAMC與血清白蛋白的結(jié)合作用還未見報(bào)道，同時(shí)三種含硫氨基酸因結(jié)構(gòu)不同引起結(jié)合作用變化等也需要進(jìn)一步闡明。為彌補(bǔ)這些不足，本論文擬采用熒光光譜法和紫外吸收光譜法分析三種含硫氨基酸與牛血清白蛋白的相互作用，計(jì)算其結(jié)合常數(shù)、結(jié)合作用力類型、熱力學(xué)參數(shù)、結(jié)合距離、結(jié)合位點(diǎn)等，以為三種含硫氨基酸的開發(fā)與利用提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

電子分析天平(AX205DR，METTLER TOLEDO)；熒光分光光度計(jì)(PE LS 45，美國(guó)Perkin Elmer公司)；紫外分光光度計(jì)(UV-9600，北京瑞利分析儀器公司)。SAC，SACS和SAMC均來自于實(shí)驗(yàn)室化學(xué)合成(經(jīng)MS，HRMS和1H-NMR確定合成的均為目標(biāo)產(chǎn)物，純度均大于95%)；牛血清白蛋白(BSA，上海伯奧生物科技有限公司，LOT：080325)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 熒光光譜的測(cè)定

在10 mL容量瓶中依次加入2 mL pH 7.40的Tris-HCl緩沖溶液、2 mL的0.50 mol·L-1NaCl溶液，6 mL濃度為3×10-5mol·L-1的BSA溶液。取3 mL該溶液與石英比色皿中，依次加入20 μL SAC，SACS(0.05 mol·L-1)，10 μL SAMC(0.05 mol·L-1)對(duì)照溶液，共加6次，混勻，得到SAC、SACS濃度分別為：(0.00，3.31，6.57，9.80，13.0，16.1，19.2)×10-4mol·L-1的BSA混合溶液，SAMC濃度即為前面兩種氨基酸的一半。最后將反應(yīng)液分別在298和310 K溫度下保持5 min。在熒光分光光度計(jì)操作界面中，選擇熒光掃描模式。以280 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，掃描300～400 nm熒光光譜并記錄熒光強(qiáng)度的變化。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

使用Origin8.5(Origin Lab Co., Northampton, MA, USA)軟件進(jìn)行繪圖，Chemdraw繪制化合物的結(jié)構(gòu)式；使用Microsoft Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 三種含硫氨基酸與BSA相互作用的熒光光譜

圖2中，在350 nm處出現(xiàn)了較強(qiáng)的熒光峰，這是BSA分子固有的內(nèi)源熒光物質(zhì)色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸等酚型氨基酸殘基的綜合效應(yīng)所發(fā)射的熒光[3]；該峰處的熒光強(qiáng)度變化，反映了溶劑、溶質(zhì)與BSA之間的相互作用。由圖2各圖中可以看出：

(1)三種含硫氨基酸均具有熒光猝滅作用，且熒光猝滅強(qiáng)度大小分別為：SAMC>SAC>SACS。如在298 K時(shí)，SAMC隨著濃度的增加(a—g)熒光強(qiáng)度下降了362 a.u.，而SAC熒光強(qiáng)度僅下降了88 a.u，但高于SACS下降量43 a.u。

(2)三種含硫氨基酸的濃度越高，對(duì)BSA的熒光基團(tuán)猝滅作用越強(qiáng)。如在298 K時(shí)，SACS樣品中隨著濃度的增加(a—g)，熒光強(qiáng)度從627 a.u.下降為584 a.u；SAC熒光強(qiáng)度從670 a.u下降為582 a.u；SAMC熒光強(qiáng)度從639 a.u下降為277 a.u。

(3)溫度影響三種含硫氨基酸與BSA的熒光猝滅作用。如在298 K下，SAC和SAMC的熒光強(qiáng)度下降量分別為88和362 a.u，在310 K的下降量分別為78和257 a.u，溫度越高下降量越少；而在同樣條件下SACS的熒光強(qiáng)度下降量分別為43和44 a.u，猝滅效果不佳、溫度差異引起的熒光強(qiáng)度的變化較小。

綜上所述，可初步判斷SACS，SAC和SAMC均具有熒光猝滅作用，SAMC的熒光猝滅作用最強(qiáng)。

2.2 據(jù)Stern-Volmer方程確定三種含硫氨基酸對(duì)BSA的熒光猝滅作用類型

根據(jù)Stern-Volmer方程式(1)可得熒光猝滅常數(shù)。以F0/F對(duì)[Q]作圖，得到不同溫度條件下三種含硫氨基酸對(duì)BSA的Stern-Volmer函數(shù)(圖3)，由截距求得Kq和Ksv(見表1)。

F0/F=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q]

(1)

式(1)中：F和F0分別表示有無猝滅劑時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度；[Q]為猝滅劑濃度(mol·L-1)；KSV為熒光猝滅常數(shù)(L·mol-1)；Kq為雙分子猝滅速率常數(shù)[L·(mol·s)-1]；τ0為無猝滅劑時(shí)熒光分子的平均壽命(一般約10-8s)。

一般地，各類熒光動(dòng)態(tài)猝滅劑的Kq最大為(1.0～2.0)×1010L·(mol·s)-1[4-5]，且常隨溫度升高稍微增加；而靜態(tài)猝滅劑的Kq則遠(yuǎn)大于2.0×1010L·(mol·s)-1，并常隨著溫度的升高有一定程度的降低。由表1中看出：在所測(cè)條件下只有SAMC的Kq>2.0×1010L·(mol·s)-1，且隨著溫度的升高明顯降低；其他兩種氨基酸的Kq值均遠(yuǎn)小于2.0×1010L·(mol·s)-1。而且只有SAMC的KSV隨溫度的升高明顯下降，可以再次表明SAMC對(duì)BSA的猝滅作用為靜態(tài)猝滅。而SACS的KSV隨溫度的升高都有所增加，SAC無明顯差異，則表明為動(dòng)態(tài)猝滅。

因此，綜合Kq和KSV兩方面的結(jié)果，可以判斷SAMC對(duì)BSA的猝滅作用為靜態(tài)猝滅，SACS，SAC對(duì)BSA的猝滅作用為動(dòng)態(tài)猝滅。

2.3 SAMC與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)

靜態(tài)猝滅劑濃度[Q]、結(jié)合常數(shù)KA、熒光強(qiáng)度F和結(jié)合位點(diǎn)之間n的關(guān)系可用式(2)Lineweaver-Burk雙對(duì)數(shù)方程來表述。

lg(F0-F)/F=lgKA+nlg[Q]

(2)

式中：F0，F(xiàn)和[Q]含義同式(1)；KA為化合物與血清白蛋白在不同溫度下的結(jié)合常數(shù)(L·mol-1)，通過式(2)方程的截距求真數(shù)即為KA值；n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。按式(2)分別繪制SAMC與BSA在298和310 K溫度下的～的雙對(duì)數(shù)圖(圖4)后，由其截距和斜率可以求出SAMC與BSA的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(見表2)。

圖2 不同濃度SACS，SAC，SAMC與BSA相互作用的熒光發(fā)射光譜

圖3 不同溫度下三種含硫氨基酸的Stern-Volmer函數(shù)(a): 298 K; (b): 310 KFig.3 Stern-volmer function of three kinds of sulfur-containing amino acids at different temperature(a): 298 K; (b): 310 K

由表2看出：SAMC和BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n分別為1.224 0和1.294 2，即近似形成一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，為1∶1復(fù)合物；其結(jié)合常數(shù)KA數(shù)量級(jí)>103，表明它們之間的結(jié)合力較強(qiáng)，SAMC在生物體內(nèi)可以較好的儲(chǔ)存與轉(zhuǎn)運(yùn)。由圖1可以看出：三種含硫氨基酸都含有相同的烯丙基和丙氨酸的結(jié)構(gòu)，其差異僅是SAMC有二硫鍵結(jié)構(gòu)，而SAC和SACS都沒有二硫鍵，說明SAMC上二硫鍵的存在使得SAMC與BSA的結(jié)合為靜態(tài)猝滅，即相互作用較強(qiáng)。

表1 三種含硫氨基酸與BSA的線性方程、相關(guān)系數(shù)及熒光猝滅常數(shù)Table 1 Linear equations, correlation coefficients and fluorescence quenching constants of three sulfur-containing amino acids and BSA

圖4 不同溫度下三種含硫氨基酸的Stern-Volmer函數(shù)

圖5 SAMC的紫外-可見吸收光譜與熒光的光譜重疊和BSA的發(fā)射光譜

表2 SAMC與BSA結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)Table 2 SAMC and BSA binding constants and number of binding sites

2.4 SAMC與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)和作用力

小分子與蛋白質(zhì)大分子(如BSA)的作用力包括氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力等[6]。Ross理論[7]認(rèn)為：當(dāng)ΔH≥0，ΔS>0時(shí)，分子間的作用力為典型的疏水作用力；當(dāng)ΔH<0，ΔS>0時(shí)主要為靜電引力；當(dāng)ΔH>0，ΔS<0主要為氫鍵和范德華力。當(dāng)溫度變化不大時(shí)，ΔH可看作一個(gè)常數(shù)。據(jù)此，可以判斷化合物與蛋白分子結(jié)合作用力的類型。

按式(2)可計(jì)算出不同溫度下SAMC與BSA作用的結(jié)合常數(shù)KA，298和310 K下的分別記為KA1和KA2。按式(3)和式(4)以lnKA對(duì)1/T作圖，求得SAMC與BSA的熱力學(xué)參數(shù)(見表3)，然后根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)判斷作用力類型[8]。

ΔG=-RTlnKA=ΔH-TΔS

(3)

(4)

式中，ΔH，ΔG和ΔS分別表示焓，自由能和熵的變化，KA1和KA2分別為298和310 K下的KA，其中T1和T2分別為298和310 K。

表3 不同溫度下SAMC的熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters of SAMC at different temperatures

據(jù)表3結(jié)果：ΔG<0，即SAMC與BSA的作用(或反應(yīng))是自由能減少、自發(fā)進(jìn)行的過程；它們作用的ΔH<0，ΔS>0，據(jù)Ross理論[7]可以判斷SAMC與BSA的結(jié)合作用力主要表現(xiàn)為靜電引力。

2.5 SAMC與BSA相互作用的結(jié)合距離[8]

對(duì)于小分子與蛋白分子結(jié)合形成絡(luò)合物，根據(jù)偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移效率(E)即F?rster理論[9][見式(5)]，可以求出結(jié)合位置相對(duì)于蛋白質(zhì)分子中發(fā)熒光基團(tuán)之間的距離(r)，r越小，藥物分子越有利于被蛋白質(zhì)存儲(chǔ)與轉(zhuǎn)運(yùn)，越能發(fā)揮其藥理作用。

(5)

式(5)中，R0是能量轉(zhuǎn)移效率E為50%時(shí)的臨界距離，R0由式(6)求出

(6)

式(6)中，K為偶極空間取向因子，N為介質(zhì)的折射指數(shù)，φ為給體的光量子效率，給體(蛋白)熒光發(fā)射光譜與受體(藥物)吸收光譜間的光譜重疊部分為J式(7)

(7)

式(7)中，F(xiàn)(λ)為熒光給體(BSA)在波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度，則ε(λ)為受體(SAMC)在波長(zhǎng)處的摩爾吸收系數(shù)，能量轉(zhuǎn)移效率E可由式(8)求出。

E=1-F/F0

(8)

將1.0×10-6mol·L-1BSA熒光發(fā)射光譜和等濃度SAMC紫外吸收光譜輸入Origin8.5軟件中作圖(圖5)，按式(7)求得圖中光譜重疊部分面積。根據(jù)文獻(xiàn)[10]報(bào)道，色氨酸的量子產(chǎn)率為0.118，折射指數(shù)N取水和有機(jī)物的平均值1.366，空間取向因子K2取給體和受體各向同性隨機(jī)分布的平均值2/3。將以上各量代入式(6)中，計(jì)算臨界結(jié)合距離R0。按式(8)求得能量轉(zhuǎn)移效率E，然后根據(jù)E和R0按式(5)求得結(jié)合距離r。計(jì)算可得J=8.62×10-20cm3·L·mol-1，R0=1.17 nm，E=0.13，r=1.61 nm。當(dāng)BSA發(fā)射熒光時(shí)，BSA的發(fā)射光譜與SAMC的紫外吸收光譜應(yīng)有足夠的重疊，最大距離不應(yīng)超過7 nm[11]。而計(jì)算結(jié)果r=1.61 nm，且0.5R0

3 結(jié) 論

通過熒光光譜法和紫外吸收光譜法研究了BSA與SAC，SACS和SAMC的相互作用，其與SAMC之間是靜態(tài)猝滅，與SAC和SACS之間則是動(dòng)態(tài)猝滅；SAMC與BSA相互作用的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)接近1；兩者主要以靜電引力結(jié)合的距離r=1.61 nm。其結(jié)合的熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)ΔH為-7.06 kJ·mol-1；298和310 K下的ΔG分別為-21.63和-22.21 kJ·mol-1；對(duì)應(yīng)溫度下的ΔS分別為48.89和46.99 J·mol-1·K-1。這些結(jié)果也為進(jìn)一步研究三種含硫氨基酸與BSA等大分子的相互作用、開發(fā)與利用提供了理論依據(jù)。