朱成雷， 穆晶晶， 徐靜雯， 王琳琳， 周鄭坤， 鄭元林， 陳才法△

（江蘇師范大學(xué) 1健康科學(xué)學(xué)院，2生命科學(xué)學(xué)院，江蘇徐州221009）

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）已經(jīng)發(fā)展成為全球性疾病，其發(fā)病率在新興工業(yè)化國(guó)家呈上升趨勢(shì)，而在西方發(fā)達(dá)國(guó)家則一直為高患病率［1］。炎癥性腸病主要包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病，其中潰瘍性結(jié)腸炎為其主要形式，其主要臨床特征為彌漫性炎癥，包括直腸黏膜改變，近端結(jié)腸長(zhǎng)度改變和更嚴(yán)重的遠(yuǎn)端結(jié)腸病變等［2］，其發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，大多認(rèn)為是由飲食習(xí)慣，環(huán)境，免疫調(diào)節(jié)，腸道微生物等多種因素共同作用的結(jié)果［3］。有實(shí)驗(yàn)表明，腸上皮屏障功能在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病中起著重要作用［4-6］，腸道屏障損傷會(huì)使黏膜的通透性增加，使腔內(nèi)環(huán)境中的病原體，毒素和抗原滲透到黏膜組織中，從而誘發(fā)炎癥［7-8］。緊密連接的完整性決定了腸上皮屏障功能［9-10］，在潰瘍性結(jié)腸炎患者中，上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 的表達(dá)減弱，而在上調(diào)了ZO-1、occludin表達(dá)后，腸道炎癥癥狀減輕［11-13］。天然產(chǎn)物紫甘薯花青素（purple sweet potato anthacyanin，PSPA）是黃酮類化合物，具有眾多藥用價(jià)值，大量文獻(xiàn)報(bào)道了其抗氧化，抗腫瘤和降血脂等功效［14-16］。.已有實(shí)驗(yàn)證明原花青素對(duì)于腸炎中緊密連接蛋白具有一定的調(diào)節(jié)作用［17-18］，但紫甘薯花青素對(duì)于腸黏膜屏障的作用尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究主要探討紫甘薯花青素對(duì)葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸上皮緊密蛋白表達(dá)的影響，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和研究有關(guān)治療方法提供理論基礎(chǔ)。

材料和方法

1 藥物、試劑和儀器

葡聚糖硫酸鈉（相對(duì)分子質(zhì)量36 000～50 000 Mw；MP Biomedicals）；青島花青素干粉（青島鵬遠(yuǎn)康華天然產(chǎn)物有限公司；色價(jià)E1%1cm=106）；兔抗GAPDH單克隆抗體購(gòu)自Abways Technology；兔抗ZO-1 多克隆抗體、兔抗 occludin 多克隆抗體、鼠抗 TNF-α 單克隆抗體和兔抗IL-6多克隆抗體均購(gòu)自Proteintech；隱血測(cè)試盒（聯(lián)苯胺法）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海生物生工有限公司；糖原PAS 染色液和天狼星紅染色試劑盒均購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司；5-氨基水楊酸（5-aminosalicylic acid，5-ASA）購(gòu)自北京酷爾化學(xué)有限公司。TGL-18000CR 高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；TS2R 倒置熒光顯微鏡（Nikon）；ESP-300電泳儀，VE-180 垂直電泳槽和VE-186 轉(zhuǎn)移電泳槽（上海天能科技有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性 BALB/c 小鼠（42 只，體重 25～30 g）購(gòu)自南京醫(yī)科大學(xué)，許可證號(hào)為SCXK（蘇）2016-0002。

3 方法

3.1 小鼠造模與分組治療 將小鼠分為正常飲水組（normal組）、模型（model）組、紫甘薯花青素（12.5、25、50 和75 mg/kg）組和5-ASA（75 mg/kg）陽(yáng)性藥物對(duì)照組，每組各6 只，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)2 周。采用2.5% DSS 溶液自由飲用構(gòu)建小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，每3 d 配制一次新鮮的DSS 溶液。除正常組給予蒸餾水外，其余各組采用自由飲用2.5%的DSS 溶液連續(xù)7 d，誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎模型，第8天開(kāi)始全部換成蒸餾水。造模第1 天即開(kāi)始灌胃給藥，除正常組與模型組給予蒸餾水外，其余各組通過(guò)灌胃方式給予相對(duì)應(yīng)劑量的藥物，連續(xù)給藥8 d。

3.2 小鼠結(jié)腸標(biāo)本的采集 實(shí)驗(yàn)期間，每天觀察并記錄小鼠的體重變化、活動(dòng)情況、毛發(fā)色澤、大便性狀和便血情況。造模第9 天脫頸處死小鼠。所獲的腸管分成兩份，一份固定于4%的多聚甲醛，4℃處理3 d 后，將其轉(zhuǎn)移至70%的無(wú)水乙醇于-20℃冰箱保存，另一份則于-80℃超低溫冰箱中保存。

3.3 潰瘍性結(jié)腸炎的評(píng)估 通過(guò)對(duì)小鼠體重變化、疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）評(píng)分判斷標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1，用結(jié)腸長(zhǎng)度、組織學(xué)損傷來(lái)評(píng)估小鼠的潰瘍性結(jié)腸炎的治療情況和是否成功構(gòu)建潰瘍性結(jié)腸炎模型。取預(yù)先通過(guò)4%多聚甲醛固定后的結(jié)腸組織，常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片，HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病變情況，并對(duì)小鼠結(jié)腸組織切片進(jìn)行組織學(xué)損傷評(píng)分，判斷標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。每個(gè)組織切片隨機(jī)選取3個(gè)以上高倍視野（×400），由2人進(jìn)行盲法評(píng)分，取平均值作為最終結(jié)果。

表1 疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分判斷標(biāo)準(zhǔn)Table 1.The score scales for the disease activity index

表2 組織學(xué)損傷評(píng)分判斷標(biāo)準(zhǔn)Table 2.The criterion for judgement of histological injury score

3.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá) 小鼠結(jié)腸組織經(jīng)4%的多聚甲醛固定后，石蠟切片。經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟后使用檸檬酸鈉修復(fù)液，用電磁爐沸水中加熱，對(duì)其進(jìn)行抗原熱修復(fù)，3%的過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，山羊血清封閉非特異性抗原，加 I 抗兔抗 ZO-1（1∶50），兔抗 occludin（1∶50）、鼠抗 TNF-α（1：200）和兔抗 IL-6（1∶200）4℃過(guò)夜。后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗，之后經(jīng)DAB 顯色、蘇木素復(fù)染、流水返藍(lán)、梯度乙醇溶液和二甲苯脫水，蓋玻片封片。顯微40 倍物鏡下隨機(jī)選擇3 個(gè)以上視野拍照，利用Image J 軟件對(duì)所測(cè)目的蛋白進(jìn)行半定量分析，以其陽(yáng)性蛋白所占面積表示蛋白表達(dá)強(qiáng)度。

3.5 糖原PAS 染色檢測(cè)結(jié)腸組織杯狀細(xì)胞中黏液素的表達(dá) 小鼠結(jié)腸組織石蠟切片經(jīng)脫蠟和水化后，蒸餾水浸洗，滴加高碘酸溶液，室溫放置1.5 h，蒸餾水浸洗，滴加希夫試劑于37℃烘箱中浸染20 min，蒸餾水沖洗10 min，入蘇木素染核1.5 min，酸性乙醇分化3 s，蒸餾水沖洗10 min，使其返藍(lán)，逐級(jí)脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固，顯微鏡下觀察拍照。

3.6 Western blot 法檢測(cè)小鼠結(jié)腸ZO-1 和occludin的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)第9天，取小鼠結(jié)腸組織，用RIPA裂解液裂解后勻漿，提取小鼠結(jié)腸組織總蛋白，BCA 法測(cè)定所得蛋白濃度，8%～12%的SDS-PAGE 分離蛋白，后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，轉(zhuǎn)膜后在10%的牛奶中室溫下封閉1 h，后膜于5%BSA 稀釋的Ⅰ抗中4℃孵育過(guò)夜，加入帶有HRP標(biāo)記的Ⅱ抗稀釋液，室溫孵育2 h，ECL 法發(fā)光，膠片顯影，掃描，保存圖片，ImageJ軟件分析結(jié)果。

3.7 天狼星紅染色檢測(cè)小鼠結(jié)腸纖維化情況 小鼠結(jié)腸石蠟切片經(jīng)脫蠟和水化后，滴加天狼星紅染色液，室溫孵育1 h，流水簡(jiǎn)單沖洗，蘇木素染核8 min，流水沖洗10 min，返藍(lán)，脫水，顯微鏡下觀察，拍照。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本文所有數(shù)據(jù)均采用Graphpad Prism 6 軟件進(jìn)行分析。各組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異采用單因素方差分析（one-way ANOVA）比較，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 紫甘薯花青素對(duì)于潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體重、疾病活動(dòng)指數(shù)、結(jié)腸長(zhǎng)度及組織學(xué)改變的影響

造模第 9 天，正常組、模型組和12.5、25、50、75mg/kg 紫甘薯花青素組小鼠體重差異明顯。與模型組相比，紫甘薯花青素治療組小鼠體重下降趨勢(shì)明顯得到抑制，體重顯著增加（P＜0.05），見(jiàn)圖1A。其DAI 指數(shù)依次0.00±0.00、11.67±0.52、10.00±1.10、3.83±0.75、5.33±0.82、8.17±1.94和7.17±1.60。與正常組相比，模型組小鼠的DAI 評(píng)分顯著增加，但紫甘薯花青素治療組與模型組相比DAI 評(píng)分顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖1B。同樣紫甘薯花青素治療組也能改善由于腸炎引起的小鼠腸道變短，見(jiàn)圖1C，紫甘薯花青素能夠明顯增加結(jié)腸長(zhǎng)度。通過(guò)HE 染色來(lái)觀察小鼠結(jié)腸組織學(xué)改變，正常組小鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)完整，無(wú)炎癥，隱窩完整，杯狀細(xì)胞豐富；模型組小鼠結(jié)腸壁明顯增厚，炎癥嚴(yán)重，病變深度達(dá)漿膜層，隱窩完全被破壞，杯狀細(xì)胞消失；各劑量紫甘薯花青素組以及陽(yáng)性藥物對(duì)照組均能改善炎癥引起的組織學(xué)改變，其中25 mg/kg 組改善效果最為明顯，其治療效果明顯優(yōu)于高濃度的PSPA 組，見(jiàn)圖2。其組織學(xué)評(píng)分見(jiàn)表3。

Figure 1.The effects of purple sweet potato anthocyanins on body weight（A），disease activity index（B）and colonic length（C）in ulcerative colitis mice.Mean±SEM. n=6.##P＜0.01 vs normal group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.圖1 紫甘薯花青素對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體重、疾病活動(dòng)指數(shù)和結(jié)腸長(zhǎng)度的影響

Figure 2.The effect of purple sweet potato anthocyanin on histological injury in ulcerative colitis mice.The images of colon sections with HE staining were showed（×400）.圖2 紫甘薯花青素對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠組織學(xué)損傷的影響

表3 紫甘薯花青素對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠組織學(xué)評(píng)分的影響Table 3.The effect of purple sweet potato anthocyanin on histological score of ulcerative colitis mice（Mean±SEM. n=4）

2 紫甘薯花青素對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道緊密連接蛋白表達(dá)的影響

由圖3可見(jiàn)，緊密連接蛋白ZO-1和occludin在正常組中呈陽(yáng)性表達(dá)分布，多為棕黃色染色；與正常組相比，模型組中ZO-1和occludin這2個(gè)蛋白的表達(dá)均降低，各劑量紫甘薯花青素組以及陽(yáng)性藥物對(duì)照組這2個(gè)蛋白的表達(dá)均有所升高，其中25 mg/kg的紫甘薯花青素治療組效果最優(yōu)（P＜0.01）。Western blot結(jié)果同免疫組化結(jié)果類似，同樣也表明25 mg/kg 的紫甘薯花青素對(duì)緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 的表達(dá)上調(diào)效果最優(yōu)，見(jiàn)圖4。

3 紫甘薯花青素對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠炎癥因子表達(dá)的影響

如圖5所示，模型組小鼠結(jié)腸中炎癥因子TNF-α和IL-6 的表達(dá)較多，但經(jīng)過(guò)紫甘薯花青素治療后，其中炎癥因子表達(dá)分布降低，且25 mg/kg 的紫甘薯花青素治療組結(jié)腸中的炎癥因子表達(dá)分布最少（P＜0.01），要優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥物的治療效果。

4 紫甘薯花青素對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠黏液素表達(dá)的影響

如圖6所示，通過(guò)PAS染色技術(shù)將小鼠結(jié)腸組織杯狀細(xì)胞中的粘液素染成紫紅色，模型組中粘液素的表達(dá)與分布明顯低于正常組，但經(jīng)治療后杯狀細(xì)胞中的黏液素表達(dá)與分布明顯增多，且其中25 mg/kg紫甘薯花青素治療組杯狀細(xì)胞中的黏液素表達(dá)與分布較模型組相比增加最為明顯。

5 紫甘薯花青素對(duì)于潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道纖維化程度的影響

如圖7 所示，通過(guò)天狼星紅染色來(lái)觀察小鼠結(jié)腸組織的纖維化情況。模型組的纖維化情況較正常組明顯加重，纖維化主要集中在黏膜下層，經(jīng)紫甘薯花青素治療之后，小鼠纖維化情況得到明顯改善，黏膜下層膠原纖維減少，且其中25 mg/kg 紫甘薯花青素治療組治療效果最為明顯。

討 論

隨著人們飲食習(xí)慣的改變，目前潰瘍性結(jié)腸炎的患病率在全球范圍內(nèi)呈持續(xù)上升趨勢(shì)，其已經(jīng)嚴(yán)重影響了人們的健康。本文以紫甘薯花青素針對(duì)腸屏障功能的修復(fù)作用來(lái)探討其對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的治療效果。

Figure 3.The effects of purple sweet potato anthocyanin on the expression and distribution of intestinal tight junction proteins in ulcerative colitis mice.The images of colon sections with immunohistochemical staining were showed（×400）.Mean±SEM.n=3.##P＜0.01 vs normal group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.圖3 紫甘薯花青素對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道緊密連接蛋白表達(dá)及分布的影響

我們以DSS 為造模藥物，通過(guò)2.5%DSS 水溶液自由飲用的方式來(lái)構(gòu)建小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型。該造模方法簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，臨床癥狀及病理學(xué)改變與人體潰瘍性結(jié)腸炎模型類似，適用于針對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎藥物作用的研究［19］。通過(guò)體重下降、疾病活動(dòng)指數(shù)、結(jié)腸長(zhǎng)度等可以確定模型是否構(gòu)建成功。本文成功構(gòu)建了小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，造模后，小鼠均表現(xiàn)出體重下降，進(jìn)食減少，出現(xiàn)血便等現(xiàn)象，且通過(guò)結(jié)腸組織學(xué)觀察也顯示出小鼠結(jié)腸縮短，黏膜糜爛，黏膜下層、漿膜層均被破壞，而陽(yáng)性對(duì)照藥物5-ASA 組與紫甘薯花青素治療組小鼠結(jié)腸的組織學(xué)狀況均優(yōu)于模型組，炎癥癥狀明顯得到改善，故紫甘薯花青素對(duì)于潰瘍性結(jié)腸炎具有治療效果。

在正常情況下，腸道具有完整的屏障功能，能防止腸腔內(nèi)致病性抗原侵入機(jī)體，維持機(jī)體正常運(yùn)行。但當(dāng)腸上皮緊密連接蛋白受損后，腔內(nèi)各種病原微生物侵入機(jī)體，引起黏膜的炎癥和免疫反應(yīng)［20］。本文通過(guò)檢測(cè)緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 在結(jié)腸中的分布與表達(dá)來(lái)判斷結(jié)腸的腸道屏障完整性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，紫甘薯花青素能夠明顯改善由潰瘍性結(jié)腸炎引起的腸道屏障受損，經(jīng)免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)模型組中緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 在結(jié)腸中的分布較正常組減少，炎癥因子IL-6 和TNF-α 的分布較正常組增加，經(jīng)Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 在模型組中表達(dá)下降，炎癥因子TNF-α 在模型組中表達(dá)上升，證明潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的腸道屏障已經(jīng)受損。但是經(jīng)過(guò)PSPA 治療后，緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 在結(jié)腸中的分布與表達(dá)較模型組均有明顯上升，且炎癥因子IL-6 和TNF-α 的分布與表達(dá)均有顯著下降。黏液素為杯狀細(xì)胞分泌的，覆蓋在胃腸道上皮細(xì)胞表面的黏液，其能夠隔離上皮細(xì)胞與各種病原微生物的接觸，當(dāng)炎癥發(fā)生后，杯狀細(xì)胞受損，黏液素分泌減少［21］。利用PAS糖原染色可以將小鼠結(jié)腸中的黏液素染成紫紅色。經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組中的黏液素明顯減少，但紫甘薯花青素治療組中小鼠結(jié)腸組織中的黏液素較模型組明顯增多。表明紫甘薯花青素可能通過(guò)維持腸道屏障的完整性來(lái)抑制炎癥的發(fā)生，從而達(dá)到減輕炎癥的目的。

Figure 4.The effect of purple sweet potato anthocyanin on the protein expression of ZO-1 and occludin in the ulcerative colitis mice.Mean±SEM. n=3.##P＜0.01 vs normal group；**P＜0.01 vs model group.圖4 紫甘薯花青素對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道緊密連接蛋白ZO-1和occludin表達(dá)的影響

組織重塑和纖維化是炎癥性腸病的特征，在潰瘍性結(jié)腸炎中，結(jié)腸黏膜下層的纖維肌閉塞，結(jié)腸纖維化嚴(yán)重［22-23］。利用天狼星紅染色可以將結(jié)腸中的膠原纖維染成紅色。經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，紫甘薯花青素能夠有效緩解由潰瘍性結(jié)腸炎引起的結(jié)腸纖維化狀況。

綜上所述，在由DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型中，體重變化，疾病活動(dòng)指數(shù)，組織學(xué)評(píng)分，結(jié)腸長(zhǎng)度以及結(jié)腸纖維化程度均反映紫甘薯花青素能夠明顯改善潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的癥狀。緊密連接蛋白，炎癥因子以及黏液素的表達(dá)情況，初步證明了，紫甘薯花青素可能通過(guò)維護(hù)腸道屏障的完整性來(lái)阻止外界病原微生物進(jìn)入腸內(nèi)，從而達(dá)到抑制炎癥產(chǎn)生的目的，且其并非呈現(xiàn)出隨劑量上升治療效果越好的趨勢(shì)，只有在25 mg/kg 紫甘薯花青素組中治療效果最優(yōu)。DSS 主要是通過(guò)增加腸道通透性以及損傷腸道屏障來(lái)發(fā)展腸道炎癥，其主要影響上皮細(xì)胞緊密連接蛋白如ZO-1 和occludin 等來(lái)?yè)p傷腸道屏障，從而增加TNF-α和IL-6 等炎癥因子的表達(dá)［24-26］。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，紫甘薯花青素主要通過(guò)增加緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 的表達(dá)與分布來(lái)保護(hù)腸道屏障完整性，從而抑制炎癥因子TNF-α 和IL-6 的釋放，改善由DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎癥狀。本實(shí)驗(yàn)為紫甘薯花青素的藥理研究與功能開(kāi)發(fā)提供了一些實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Figure 5.The effect of purple sweet potato anthocyanin on the protein expression of TNF-α and IL-6 in the ulcerative colitis mice by immunohistochemical staining（×400）of colon sections of mice（A）and TNF-α expression by Western blot（B）.Mean±SEM. n=3.#P＜0.05 vs normal group；**P＜0.01 vs model group.圖5 紫甘薯花青素對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠炎癥因子TNF-α和IL-6表達(dá)和分布的影響

Figure 6.The effect of purple sweet potato anthocyanin on mucin expression in the ulcerative colitis mice.Glycogen PAS staining of colon sections of mice was showed（×400）.圖6 紫甘薯花青素對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠黏液素表達(dá)的影響

Figure 7.The effect of purple sweet potato anthocyanin on the degree of intestinal fibrosis in ulcerative colitis mice.Sirius red staining of colon sections of mice was showed（×400）.圖7 紫甘薯花青素對(duì)于潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道纖維化程度的影響