張翊玲， 曹 穎， 鄭夢凝， 姚紅梅， 路 蘋， 葉賢偉

（貴州省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，國家衛(wèi)生健康委員會肺臟免疫性疾病診治重點實驗室，貴州貴陽550002）

支氣管哮喘是呼吸系統的常見病與多發(fā)病，由嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、氣道上皮細胞和肥大細胞等多種細胞及其產生的細胞因子與炎癥介質共同作用導致的氣道慢性炎癥疾病。全球哮喘的發(fā)病率呈進行性上升趨勢，支氣管哮喘的發(fā)病機制錯綜復雜，雖然目前對支氣管哮喘發(fā)病機制的研究取得了巨大進步，但支氣管哮喘有不同亞型和不同表型，因此支氣管哮喘發(fā)病機制仍需繼續(xù)深入［1-4］。相關研究顯示，可溶性磷脂酶A2-X（soluble phospholipase A2-X，sPLA2-X）與支氣管哮喘發(fā)病密切關聯。磷脂酶A2可水解催化磷脂生成溶血磷脂和自由脂肪酸，而自由脂肪酸是合成前列腺素（prostaglandin，PG）和花生四烯酸（arachidonic acid，AA）的前體，促進炎癥反應。肺部富含磷脂酶A2，在支氣管哮喘發(fā)病中，PLA2 通過從膜磷脂中水解釋放花生四烯酸，進一步代謝生成前列腺素和白三烯（leukotriene，LT）而釋放大量的炎癥介質，導致炎癥的發(fā)生。它將損傷因素、炎癥細胞、內毒素、細胞因子和脂類遞質等細胞有形成分和可溶分子物質聯系起來，成為該體系中最重要的活性酶。PLA2 水解膜磷脂釋放的炎癥或過敏性遞質，是哮喘發(fā)生發(fā)展的重要促進因素［5-7］。野生型小鼠哮喘模型的肺組織中sPLA2-X 表達顯著增加。sPLA2-X 與支氣管哮喘呈正相關，敲除或抑制sPLA2-X后哮喘癥狀改善明顯。然而與磷脂酶A2-X相關的研究多集中在巨噬細胞與氣道上皮細胞，針對其與嗜酸性粒細胞是否存在重要關聯的相關研究鮮少，由于嗜酸性粒細胞在支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展中扮演非常重要的角色（嗜酸性粒細胞激活后釋放大量的炎癥介質促進哮喘發(fā)展［8-10］）。本研究通過嗜酸性粒細胞刪除后觀察sPLA2-X 的表達情況，旨在探索sPLA2-X 與嗜酸性粒細胞的關聯，進一步明確sPLA2-X 與支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展的內在聯系，為哮喘的治療提供新的策略與思路。

材料和方法

1 材料

48 只雌性 6～8 周齡 Balb/c 小鼠，體質量約 18～20 g 購買于貴州醫(yī)科大學動物房，動物證書編號為SYXK（黔）2018-0001。卵清蛋白（ovalbumin，OVA）及Al（OH）3凝膠均購自Sigma；測量血清IgE、白細胞介素（interleieukin，IL）-4、IL-5、IL-13 含量的 ELISA試劑盒購自BD 及R&D；抗趨化因子受體CCR3 單克隆抗體及同型對照購買于R&D；測量sPLA2-X 的ELISA 試劑盒購自Abcam。無創(chuàng)肺功能儀購自BUXCO；超聲霧化器購自Boehringer-Ingelheim。

2 方法

2.1 實驗分組 SPF 級 6～8 周雌性 Babl/c 小鼠 48只，分為4 組，每組12 只，分為健康對照組（Saline/Saline 組）；哮喘對照組（OVA/Saline 組）；哮喘/嗜酸性粒細胞刪除組（OVA/anti-CCR3 組）和哮喘/嗜酸性粒細胞刪除同型對照組（OVA/anti-CCR3-isotype組）。

2.2 小鼠支氣管哮喘模型的建立 健康對照組小鼠于0、7 和14 d 腹腔注射生理鹽水，其余組每只小鼠分別腹腔注射50 μg OVA 與2 mg 氫氧化鋁凝膠（溶于200 μL生理鹽水）。

2.3 嗜酸性粒細胞刪除抗體的處理 根據分組于第21 天每只小鼠腹腔注射50 μg anti-CCR3 單克隆抗體或同型對照（溶于0.15 mL PBS），于第26 天將小鼠進行異氟烷吸入麻醉（不宜麻醉過深或過淺），待麻醉合適后，進行單鼻孔緩慢吸入（防止小鼠打噴嚏、嗆咳）anti-CCR3 單克隆抗體或同型對照25 μg 滴鼻加強［11-13］。

2.4 小鼠支氣管哮喘模型霧化激發(fā) 實驗第27、28和29 天，除健康對照組給予生理鹽水（saline）霧化外，其余組小鼠均給予2% OVA 霧化吸入45 min，當小鼠出現擦鼻、流涎、呼吸急促及口唇發(fā)紺、腹式呼吸加快、漸出現呼吸困難時停止，每天1 次。連續(xù)霧化3 d。

2.5 無創(chuàng)肺功能儀檢測小鼠氣道反應性 小鼠于霧化結束后48 h 內完成肺功能檢測。采用全身體積描記法，全身體積描記法具有無約束的特點，可以對清醒自由活動的小動物進行肺功能及氣道反應相關的測試，避免了創(chuàng)傷性氣管切開術及麻醉的影響。無創(chuàng)肺功能儀器可每次檢測6只小鼠，有6個傳感器罩，由肺功能檢測的專門技術人員調試機器與監(jiān)督。無創(chuàng)肺功能檢測共計分baseline、NS（生理鹽水）、6.25、12.5、25、50、100和200 mmol/L 乙酰甲膽堿共6 個梯度，每個濃度試劑每次給予300 μL 用于霧化，每次霧化1 min，緩沖1 min，作用3 min，記錄1 min。通過霧化吸入不同濃度的乙酰甲膽堿，觀察指標包括累積氣量、呼吸頻率、吸氣末暫停、最大吸入流速、最大呼出流速等綜合計算出增強呼氣間歇（enhanced pause，Penh）值，該值與小鼠氣道反應的基礎值（baseline）比較，如果在較低的乙酰甲膽堿（methacholine，MCh）濃度下Penh 值呈大幅度上升且變異性大，表明氣道反應高，而氣道高反應（airway hyperresponsiveness，AHR）是哮喘的重要特點，一般情況下AHR越高，哮喘越重。

2.6 標本的收集及處理 各組小鼠經麻醉摘眼球取血后，收集至抗凝的EP 管中，并4 ℃靜置0.5 h，1 500 r/min離心10 min后收集分裝血清，并置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。于常?guī)處死小鼠后立即行小鼠支氣管肺泡灌洗術：每組小鼠一半行全肺灌洗、一半肺組織用于肺組織切片HE檢測：即肺組織置入4%多聚甲醛，固定24 h 后進行脫水、二甲苯透明、包埋及切片等，用于HE染色。

小鼠肺泡灌洗方法：用75%乙醇將小鼠頸部皮膚進行消毒后置小鼠于仰臥位，并用注射器針頭將其固定，用眼科剪小心剪開小鼠頸部皮膚，并用眼科鑷子將皮膚下結締組織與肌肉進行鈍性分離，暴露氣管后，沿隆突方向插入24 G 靜脈留置針，用1 mL注射器抽吸0.8 mL PBS，將PBS 經留置針管緩緩注入氣管并將PBS 緩緩回抽，可見回抽出帶乳白色泡沫狀的液體，每次0.8 mL PBS 反復回抽3 遍，最后可回抽出0.65～0.70 mL 灌洗液，并收集于無菌EP 管中，每只小鼠重復該灌洗3 次，可收集支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）約2 mL，以1 500 r/min 將 BALF 離心 10 min 可見離心管底部出現乳白色細胞沉淀。肺泡灌洗液沉淀用于細胞計總數與細胞染色計數及分類。取上清液分裝，并置于-80 ℃保存用于細胞因子檢測。細胞沉淀經100 μL PBS 重懸后取部分涂片，在無菌操作臺中風干后用4%多聚甲醛固定行HE染色。

2.7 ELISA 方法檢測 BALF 中 sPLA2-X、IL-4、IL-5和IL-13及血清中sPLA2-X和總IgE水平 所有檢測均嚴格遵照說明書操作，并通過讀取450 nm 處標準品吸光度（A）值，繪制相應的標準曲線，定量檢測sPLA2-X、IL-4、IL-5和IL-13及總IgE的含量。

以上哮喘模型構建、肺功能檢測及BALF細胞計數等方法同參考文獻［14-17］。

3 統計學處理

本研究采用SPSS 18.0 軟件處理數據。所有計量資料均經過正態(tài)檢驗，以均數±標準差（mean±SD）表示，兩組比較用t檢驗，或非正態(tài)分布數據以中位數（下四分位數，上四分位數）表示，并用Mann-Whitney U 檢驗進行比較；多個樣本均數間比較采用單因素方差分析或SNK-q檢驗。采用GraphPad Prism 6作圖。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 刪除嗜酸性粒細胞顯著減輕氣道和肺泡炎癥反應

與健康對照組相比，哮喘對照組氣道周圍炎癥細胞浸潤明顯，肺泡間隔增厚、間隔不連續(xù)或斷裂、肺泡水腫明顯；而嗜酸性粒細胞刪除組炎癥細胞浸潤及肺泡水腫、增厚等表現明顯改善，可見視野清晰，間隔連續(xù)，肺泡間隔均勻，少許炎癥細胞浸潤。該結果顯示嗜酸性粒細胞刪除可顯著減輕氣道、肺泡炎癥反應。見圖1。

Figure 1.The observation of lung tissues in different groups with HE staining（×200）.Bright blue color indicated that the nuclei was stained with hematoxylin，and the color varies from pink to dark red indicated that the cytoplasm was stained with eosin.圖1 小鼠肺組織病理切片HE染色觀察

2 Anti-CCR3 可成功刪除嗜酸性粒細胞，并能顯著降低支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞的百分比

與健康對照組相比較，哮喘模型組小鼠BALF中嗜酸性粒細胞百分比顯著升高；與哮喘對照組比較，哮喘/嗜酸性粒細胞刪除組小鼠BALF 中的嗜酸性粒細胞百分比顯著降低（P＜0.01），見圖2。

Figure 2.The cell count and percentage of various types of cells in mouse bronchoalveolar lavage fluid.Mean±SD. n=6.##P＜0.01 vs Saline/Saline group；**P＜0.01 vs OVA/Saline group.圖2 小鼠支氣管肺泡灌洗液細胞計數與各類細胞百分比的比較

3 刪除嗜酸性粒細胞可降低氣道高反應

哮喘對照組的Penh 值隨著MCH 濃度的遞增上升幅度最大、最顯著；與哮喘對照組相比較，哮喘/嗜酸性粒細胞刪除組小鼠的Penh 值隨著MCH 濃度遞增，其上升幅度顯著減低，該結果表明刪除嗜酸性粒細胞顯著降低氣道高反應，見圖3。

4 刪除嗜酸性粒細胞的小鼠BALF 中的sPLA2-X水平明顯降低

與健康對照組相比較，哮喘模型小鼠BALF 中sPLA2-X 表達的水平顯著增加（P＜0.01）；與哮喘對照組比較，哮喘/嗜酸性粒細胞刪除組小鼠BALF 中的sPLA2-X水平明顯降低（P＜0.01），見圖4。

5 刪除嗜酸性粒細胞小鼠血清中的sPLA2-X 水平明顯降低

與健康對照組相比較，哮喘模型小鼠血清中的sPLA2-X 水平顯著增加（P＜0.01）；與哮喘對照組比較，哮喘/嗜酸性粒細胞刪除組小鼠血清中的sPLA2-X水平明顯降低（P＜0.01），見圖5。

6 刪除嗜酸性粒細胞可降低小鼠BALF 中IL-4、IL-5和IL-13及血清中IgE的水平

與正常對照組相比較，哮喘模型小鼠BALF中的IL-4、IL-5和IL-13 及血清中總 IgE 的水平顯著升高，而哮喘/嗜酸性粒細胞刪除組小鼠BALF 中的IL-4、IL-5和IL-13 及血清中總 IgE 的水平顯著降低（P＜0.01），見圖6～9。

Figure 3.The airway responsiveness of the mice in each group was tested with different concentrations of methacholine.Mean±SD. n=6.##P＜0.01 vs Saline/Saline group；**P＜0.01 vs OVA/Saline group圖3 在不同濃度乙酰甲膽堿激發(fā)下，各組小鼠氣道反應性的變化

Figure 4.The levels of sPLA2-X in bronchoalveolar lavage fluid of the mice in different groups.Mean SD. n=6.##P＜0.01 vs Saline/Saline group；**P＜0.01 vs OVA/Saline group.圖4 各組小鼠肺泡灌洗液中sPLA2-X水平的比較

Figure 5.The serum levels of sPLA2-X in the mice of different groups.Mean±SD. n=6.##P＜0.01 vs Saline/Saline group；**P＜0.01 vs OVA/Saline group.圖5 各組小鼠血清中sPLA2-X水平的比較

討 論

Figure 6.The levels of IL-4 in bronchoalveolar lavage fluid of the mice in different groups.The data were presented as median（interquartile range）. n=6.##P＜0.01 vs Saline/Saline group；**P＜0.01 vs OVA/Saline group.圖6 各組小鼠肺泡灌洗液中IL-4水平的比較

Figure 7.The levels of IL-5 in bronchoalveolar lavage fluid of the mice in different groups.The data were presented as median（interquartile range）. n=6.##P＜0.01 vs Saline/Saline group；**P＜0.01 vs OVA/Saline group.圖7 各組小鼠肺泡灌洗液中IL-5水平的比較

支氣管哮喘是由嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、氣道上皮細胞和肥大細胞等多種細胞及其產生的細胞因子與炎癥介質共同作用導致的氣道慢性炎癥疾病。嗜酸性粒細胞在支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用［1-3］。目前，雖對支氣管哮喘發(fā)病機制的研究已取得進步，但支氣管哮喘有不同亞型，不同表型仍需繼續(xù)深入研究其機制。磷脂酶A2 可水解催化磷脂生成溶血磷脂和自由脂肪酸，而自由脂肪酸是合成前列腺素和花生四烯酸的前體，促進炎癥反應。PLA2 水解膜磷脂釋放的炎性或過敏性遞質，是哮喘發(fā)生發(fā)展的重要促進因素。磷脂酶A2 廣泛參與人體生理性細胞內外信號的傳導及病理性炎癥、多種免疫相關疾病的發(fā)生發(fā)展［3-6］。與磷脂酶A2-X 相關的研究多集中在巨噬細胞與氣道上皮細胞，與嗜酸性粒細胞相關的研究國內外鮮少，本研究通過嗜酸性粒細胞刪除后評估sPLA2-X 的情況，旨在探索sPLA2-X與嗜酸性粒細胞的關聯，進一步明確sPLA2-X與支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展的內在聯系，為哮喘的治療提供新的策略與思路。

Figure 8.The levels of IL-13 in bronchoalveolar lavage fluid of the mice in different groups.The data were presented as median（interquartile range）. n=6.##P＜0.01 vs Saline/Saline group；**P＜0.01 vs OVA/Saline group.圖8 各組小鼠肺泡灌洗液中IL-13水平的比較

Figure 9.The serum level of total IgE in the mice of different groups.The data were presented as median（interquartile range）. n=6.##P＜0.01 vs Saline/Saline group；**P＜0.01 vs OVA/Saline group.圖9 各組小鼠血清中總IgE水平的比較

本研究結果顯示，與健康對照組相比較，哮喘對照組無論是從病理學HE 染色分析、BALF 細胞學分類、與哮喘相關的重要細胞因子IL-4、IL-5、IL-13 及血清中總IgE水平及氣道反應性方面等均顯著增高，與相關的研究結果相一致［2-5］，該結果表明本研究構建哮喘模型是成功的。與哮喘對照組相比較，哮喘/嗜酸性粒細胞刪除組從BALF細胞學分類、嗜酸粒細胞百分比、BALF 細胞因子IL-4、IL-5、IL-13 及血清中總IgE的水平、病理學改變及肺功能等方面進行綜合比較，結果顯示哮喘/嗜酸性粒細胞刪除組小鼠各項指標均有改善。目前學術界公認且研究最多的哮喘發(fā)病機制是Th2 占優(yōu)勢的Th1/Th2 免疫失衡，Th2 細胞分泌 IL-4、IL-5、IL-13和IL-9 等細胞因子，這些細胞因子能夠共同作用于氣道上皮細胞、黏液細胞及成纖維細胞、平滑肌細胞，其中IL-5 可以激活嗜酸性粒細胞并釋放組胺；IL-4 與IL-13 共同作用于B 淋巴細胞，并進一步產生IgE共同作用于肥大細胞釋放包括前列腺素、組胺、半胱氨酸、白三烯在內的炎癥介質；以上細胞因子及炎癥因子相互作用共同促進哮喘的發(fā)生與發(fā)展［1-4］。

本研究結果顯示嗜酸性粒細胞刪除組經嗜酸性粒細胞抗體刪除后，顯著減少了Th2 細胞分泌的IL-4、IL-5、IL-13 及血清中總IgE，從而抑制或減輕哮喘的發(fā)生發(fā)展。

相關文獻報道在支氣管哮喘發(fā)病中，肺部富含的PLA2通過從膜磷脂中水解釋放花生四烯酸，進一步代謝生成前列腺素和白三烯而釋放大量的炎癥介質，導致炎癥的發(fā)生，它將損傷因素、炎癥細胞、內毒素、細胞因子和脂類遞質等細胞有形成分和可溶分子物質聯系起來，成為該體系中最重要的活性酶［5-9］。本研究結果顯示小鼠哮喘模型血清、BALF中sPLA2-X 的水平增高，與相關的文獻報道一致［7-10］。與哮喘對照組相比較，哮喘/嗜酸性粒細胞刪除組血清、BALF 中的sPLA2-X 水平明顯降低，提示刪除嗜酸性粒細胞可能會直接或間接導致sPLA2-X 水平的下降，嗜酸性粒細胞與sPLA2-X存在密切關聯。

磷脂酶A2 是一種能催化磷脂甘油分子上二位酰基的水解酶，亦是花生四烯酸、前列腺素及血小板活化因子、白三烯等生物活性物質生成的限速酶，所產生的脂質介質在炎癥和組織損傷時起關鍵性作用。人類幾乎所有的細胞均含PLA2，主要為兩種亞細胞分布，一種為膜結合性PLA2（Ma-PLA2）、另一種為可溶性PLA2（s-PLA2）。sPLA2-X 是sPLA2的主要亞型之一，主要表達于哮喘患者氣道的上皮細胞、巨噬細胞［8-10］，與哮喘的嚴重程度及氣道高反應密切相關［12］，sPLA2-X 是氣道炎癥中最重要的 PLA2 亞型。嗜酸性粒細胞在支氣管哮喘發(fā)病機制中發(fā)揮重要的作用。在臨床上嗜酸性粒細胞為主的支氣管哮喘尤為常見，且本研究構建的是嗜酸性粒細胞為主的哮喘模型。相關研究顯示嗜酸性粒細胞在過敏原或各種理化因素的作用下，釋放炎癥介質包括白三烯、前列腺素等促進哮喘的發(fā)生發(fā)展，而磷脂酶A2-X 是白三烯、前列腺素產生關鍵的限速酶，因此，嗜酸性粒細胞與磷脂酶A2-X 可能存在重要的關聯。結合以上相關研究及本研究結果，嗜酸性粒細胞可能既是sPLA2-X的重要來源，同時也可能作為sPLA2-X的效應細胞釋放炎癥介質如花生四烯酸、白三烯等，共同促進哮喘的發(fā)生發(fā)展。