王旭穎， 荊明箴， 付 榮， 余 謹(jǐn)， 楊 茹

（武漢血液中心，湖北武漢430030）

急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）是一種常見的兒童血液系統(tǒng)惡性腫瘤，約占兒童惡性腫瘤的 1/8 531，年發(fā)病率為 4/10 萬［1］。盡管近年來ALL 患者的生存率得到了顯著提高，但復(fù)發(fā)仍是導(dǎo)致兒童患病死亡的最常見原因之一［2-3］，成人ALL 的難治與復(fù)發(fā)更是臨床上難以攻克的問題［4］?；熓侵委烝LL 的主要方法之一，但化療藥物耐藥的產(chǎn)生，成為限制ALL 患者臨床療效的主要障礙，因此，尋找治療ALL 的相關(guān)靶點對ALL 治療新策略的發(fā)現(xiàn)具有重要的研究意義［5］。

BTB 與 CNC 同源基因 2（BTB and CNC homology 2，BACH2）是一種具有堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，主要在T 細(xì)胞、B 細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等細(xì)胞中表達(dá)，參與了淋巴細(xì)胞的生成與功能調(diào)控過程，與多種免疫相關(guān)性疾病的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)［6-7］。BACH2 作為轉(zhuǎn)錄抑制因子，在ALL 患者骨髓中的表達(dá)低于正常人骨髓，且BACH2 低表達(dá)與白血病細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為及較差的臨床預(yù)后相關(guān)［8］。但BACH2在急性T 淋巴細(xì)胞白血病腫瘤細(xì)胞中的研究卻少有報道。本項工作探討B(tài)ACH2在ALL T 淋巴細(xì)胞CCRFCEM 與正常人外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中的表達(dá)差異，并檢測BACH2 過表達(dá)對CCRF-CEM 細(xì)胞活力及凋亡的影響，以期為BACH2 在急性T 淋巴細(xì)胞白血病中的研究提供參考資料。

材料和方法

1 材料

人急性淋巴細(xì)胞白血病T 淋巴細(xì)胞CCRF-CEM購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。RPMI-1640 培養(yǎng)液購于HyClone；胎牛血清和Opti-MEM 培養(yǎng)基購于Gibco；人全血單個核細(xì)胞分離液購于天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；Trizol 購于Ambion；反轉(zhuǎn)錄試劑Oligo（dT）18 Primer、PrimeScript II RTase和Recombinant RNase Inhibitor 購 于 TaKaRa；LipofectamineTM2000 購于 Invitrogen；CCK8 試劑盒、Triton X-100、封閉液和抗熒光淬滅封片液購于Solarbio；Annexin VPE/7-AAD 凋亡檢測試劑盒購于BD；抗BACH2 抗體（用于免疫熒光檢測）購于Abcam；細(xì)胞周期蛋白D3（cyclin D3）抗體（用于免疫熒光檢測）購于武漢三鷹生物有限公司；抗cyclin D3 抗體、抗Bcl-2 抗體及抗caspase-3 抗體（用于 Western blot 檢測）購于 Bioswamp。

2 方法

2.1 細(xì)胞分離和培養(yǎng) 取3 mL 人全血單個核細(xì)胞分離液于15 mL離心管中，加入3 mL正常人外周血，500×g離心25 min，離心管中液體分為4層：第1層為血漿層，第2 層為環(huán)狀乳白色單個核細(xì)胞層，第3 層為透明分離液層，第4 層為紅細(xì)胞層。小心吸取第2層于新的離心管中，加入10 mL清洗液，混勻，250×g離心10 min，棄上清，再加入5 mL清洗液重懸細(xì)胞沉淀，250×g離心 10 min，加入 5 mL 清洗液重復(fù)離心 1次。棄上清液，即可獲得原代PBMC。CCRF-CEM 細(xì)胞從液氮罐中取出后，解凍復(fù)蘇培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中。

2.2 qPCR 檢測細(xì)胞中 BACH2 的 mRNA 表達(dá) 采用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，加入反應(yīng)體系進行反轉(zhuǎn)錄。采用Primer Premier 5.0 軟件進行引物設(shè)計，由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成引物。以逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 為模板進行PCR 擴增，反應(yīng)程序為：95℃變性5 s，56℃退火10 s，72℃延伸25 s，共39 個循環(huán)。BACH2 的上游引物序列為5'-GGTGTGTGAGAAAGAGAAAC-3'，下游引物序列為5'-CAGGGCAATACCGATG-3'；β-actin的上游引物序列為5'-ACACTGTGCCCATCTACG-3'，下游引物序列為5'-TGTCACGCACGATTTCC-3'。 以 β -actin 為 內(nèi) 參照，采用 2-ΔΔCt法計算細(xì)胞中 BACH2 mRNA 的相對表達(dá)量。

2.3 實驗分組及處理 將CCRF-CEM 細(xì)胞分為：對照（control）組 、空 載 體（empty vector，EV）組 和BACH2 過 表 達(dá)（BACH2 over-expression，overExp BACH2）組。對照組細(xì)胞不作處理，正常培養(yǎng)；BACH2過表達(dá)組采用LipofectamineTM2000將BACH2過表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，根據(jù)BACH2基因序列（GI：1519315636）設(shè)計合成過表達(dá)引物，獲得目的片段后，重組至p-EGFP-N1 載體中，獲得重組質(zhì)粒。采用LipofectamineTM2000 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入CCRFCEM 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞接種于24 孔板中，每孔約 5×105個細(xì)胞，采用 Opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒DNA 和LipofectamineTM2000，然后將轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒DNA 稀釋液混勻，室溫靜置20 min。將轉(zhuǎn)染混合液加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，輕輕搖晃混勻后繼續(xù)培養(yǎng)；空載體組細(xì)胞轉(zhuǎn)染空載體。培養(yǎng)24 h后，采用qPCR 檢測細(xì)胞中BACH2的mRNA表達(dá)水平。

2.4 CCK8 法檢測細(xì)胞活力 轉(zhuǎn)染后，調(diào)整細(xì)胞密度接種于 96 孔板中，每孔180 μL，約5×103個細(xì)胞。培養(yǎng) 24 h，取出培養(yǎng)板，每孔加入20 μL CCK8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。酶標(biāo)儀檢測各孔在450 nm 處的吸光度（A）值。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取各組細(xì)胞懸液，1 000×g離心5 min，棄上清，加入1 mL PBS 液重懸細(xì)胞沉淀。1 000×g離心5 min，棄上清，加入100 μL 結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，再分別加入5 μL Annexin V-PE和7-AAD 染液，混勻，避光孵育15 min。加入400 μL 結(jié)合緩沖液，進行流式細(xì)胞儀上機檢測。

2.6 免疫熒光染色檢測細(xì)胞中BACH2 和cyclin D3的表達(dá) 取各組細(xì)胞懸液，PBS清洗2次，采用4%多聚甲醛于室溫下固定30 min，PBS 洗滌后加入0.5%Triton X-100室溫通透20 min，PBS洗3次。室溫下封閉 1 h 后，加入兔抗 BACH2和cyclin D3 抗體于濕盒內(nèi)，4℃孵育過夜。PBS 洗3 次，加入II 抗，37℃孵育1 h。PBS 洗 5 次，加入 100 μL 抗熒光淬滅封片液進行染色，滴1滴于載玻片上進行封片，于顯微鏡下觀察。

2.7 Western blot 檢測細(xì)胞中 cyclin D3、Bcl-2 及 caspase-3 的蛋白表達(dá) 收集對照組、空載體組和BACH2 過表達(dá)組細(xì)胞，按照每1×106個細(xì)胞加入200 μL 裂解液的比例加入裂解液，于4℃充分裂解。將細(xì)胞收集于離心管中，95℃加熱10 min，12 000×g離心10 min，取上清液進行蛋白定量。以每孔20 μg 蛋白上樣量進行SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，采用5%脫脂奶粉封閉液4℃封閉過夜。分別加入抗cyclin D3、Bcl-2 和caspase-3 抗體（稀釋比例為1∶1 000），室溫下孵育2 h，PBST清洗3次，加入II抗，室溫下孵育2 h，PBST 清洗3 次。加入化學(xué)發(fā)光試劑，采用全自動發(fā)光分析儀讀取條帶灰度值，計算蛋白的相對表達(dá)量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 BACH2在CCRF-CEM細(xì)胞中的表達(dá)

檢測人急性淋巴細(xì)胞白血病T 淋巴細(xì)胞CCRFCEM 和正常人外周血單個核細(xì)胞中BACH2基因的mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果顯示，CCRF-CEM 細(xì)胞中BACH2 的 mRNA 水平顯著低于 PBMC（P＜0.05），見圖1。

2 BACH2過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染效率的檢測

與對照組比較，空載體組細(xì)胞中BACH2 的mRNA 表達(dá)水平無顯著差異（P＞0.05），而BACH2 過表達(dá)組細(xì)胞中BACH2 的mRNA 相對表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），見圖2，說明本次轉(zhuǎn)染實驗成功獲得BACH2高表達(dá)的CCRF-CEM細(xì)胞。

Figure 1.The mRNA expression of BACH2 in PBMC and CCRF-CEM cells was detected by qPCR.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs PBMC group.圖 1 qPCR 檢測 PBMC和CCRF-CEM 細(xì) 胞 中 BACH2 的mRNA表達(dá)水平

Figure 2.The mRNA expression of BACH2 in CCRF-CEM cells was detected by qPCR.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group.圖2 qPCR檢測CCRF-CEM 細(xì)胞中BACH2的mRNA表達(dá)水平

3 BACH2過表達(dá)對CCRF-CEM細(xì)胞活力的影響

采用CCK8 實驗檢測CCRF-CEM 細(xì)胞活力的變化，與對照組比較，空載體組細(xì)胞活力無顯著變化（P＞0.05），而 BACH2 過表達(dá)組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05），見圖3。

Figure 3.The viability of CCRF-CEM cells was detected by CCK8 assay.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group.圖3 CCK8法檢測CCRF-CEM細(xì)胞活力

4 BACH2過表達(dá)對CCRF-CEM細(xì)胞凋亡的影響

檢測各組CCRF-CEM 細(xì)胞的凋亡水平，與對照組比較，空載體組細(xì)胞凋亡率無顯著變化（P＞0.05），BACH2 過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），見圖4。

Figure 4.Apoptosis rate of CCRF-CEM cells was detected by flow cytometry.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group.圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測CCRF-CEM細(xì)胞的凋亡率

5 CCRF-CEM 細(xì)胞中 BACH2和cyclin D3 表達(dá)的變化

免疫熒光染色檢測各組CCRF-CEM 細(xì)胞中BACH2 和cyclin D3 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對照組相比，BACH2 過表達(dá)組細(xì)胞中BACH2 表達(dá)增多，見圖5A，而cyclinD3表達(dá)減少，見圖5B。

Figure 5.The expression levels of BACH2（A）and cyclin D3（B）in CCRF-CEM cells were detected by immunofluorescence.圖5 免疫熒光染色檢測CCRF-CEM細(xì)胞中BACH2和cyclin D3的表達(dá)

6 BACH2 過表達(dá)對 CCRF-CEM 細(xì)胞 cyclin D3、Bcl-2和caspase-3蛋白表達(dá)的影響

Western blot 檢測各組CCRF-CEM 細(xì)胞中cyclin D3、Bcl-2和caspase-3蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對照組相比，BACH2 過表達(dá)組細(xì)胞中cyclin D3 和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平降低，而caspase-3 表達(dá)升高（P＜0.05），見圖6。

Figure 6.The protein expression levels of cyclin D3，Bcl-2 and caspase-3 in CCRF-CEM cells were detected by Western blot.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group.圖6 Western blot檢測CCRF-CEM細(xì)胞中cyclin D3、Bcl-2和caspase-3蛋白表達(dá)水平

討 論

ALL 主要表現(xiàn)為T、B 淋巴細(xì)胞異常增殖，大量未成熟的白細(xì)胞聚集浸潤骨髓及其他組織和器官，引起骨髓的造血功能發(fā)生異常和免疫功能紊亂等［9］。成人ALL 主要以兒科治療為基礎(chǔ)強化化療，但隨著年齡的增長，對高強度化療的耐受性降低，不良預(yù)后因素的發(fā)生率增加［10］，復(fù)發(fā)/難治性 ALL 急需新的治療方法［11］。由于ALL 具有高度異質(zhì)性，新分子治療靶點的開發(fā)對ALL 患者的臨床治療及預(yù)后的改善具有重大意義［12］。

BACH2 是BTB 堿性區(qū)亮氨酸拉鏈因子家族的成員之一，Sasaki 等［13］研究表明 BACH2 對 B 淋巴細(xì)胞的發(fā)育具有調(diào)控作用，BACH2基因的缺失是人類B 細(xì)胞淋巴瘤常見的染色體改變之一。BACH2 可通過多步驟調(diào)節(jié)免疫相關(guān)疾病，參與B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的發(fā)育，調(diào)控淋巴細(xì)胞的周期［14］。同時，BACH2被認(rèn)為是T 淋巴細(xì)胞維持免疫穩(wěn)定狀態(tài)的調(diào)節(jié)因子［15］。本研究顯示，ALL T 淋巴細(xì)胞中 BACH2的表達(dá)顯著低于正常人外周血單個核細(xì)胞，該結(jié)果與 Ge 等［8］研究結(jié)果相似，為了進一步探討 BACH2 在ALL T 淋巴細(xì)胞中的具體作用機制，我們通過上調(diào)BACH2 在CCRF-CEM 細(xì)胞中的表達(dá)，觀察過表達(dá)BACH2對CCRF-CEM細(xì)胞活力和凋亡的影響。

細(xì)胞周期的失調(diào)在腫瘤的發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，cyclin D3 是細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換的重要正調(diào)控因子，染色質(zhì)免疫沉淀實驗發(fā)現(xiàn)BACH2可直接調(diào)控cyclin D3，進而調(diào)控淋巴細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換［14］。破壞細(xì)胞活力和凋亡之間的生理平衡是腫瘤發(fā)展的重要步驟之一，細(xì)胞凋亡抵抗是血液系統(tǒng)惡性腫瘤的關(guān)鍵機制［16］。Bcl-2 家族在細(xì)胞內(nèi)源性凋亡通路中發(fā)揮重要作用，Bcl-2 家族蛋白可調(diào)控線粒體膜電位及通透性，當(dāng)線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C 釋放至細(xì)胞質(zhì)時，可激活caspase 凋亡級聯(lián)反應(yīng)，而caspase-3 則為凋亡執(zhí)行因子［17-18］。本研究結(jié)果顯示，BACH2 過表達(dá)抑制了CCRF-CEM 細(xì)胞的活力，促進其發(fā)生凋亡，且細(xì)胞中cyclin D3和Bcl-2 蛋白表達(dá)下調(diào)，而 caspase-3 表達(dá)上調(diào)，提示BACH2 通過參與細(xì)胞內(nèi)源性凋亡途徑誘導(dǎo)CCRF-CEM 細(xì)胞凋亡。研究顯示［19］，Bcl-2 在淋巴細(xì)胞白血病中表達(dá)上調(diào)，針對Bcl-2 拮抗劑的研發(fā)成為治療白血病的方向之一，而本文中過表達(dá)BACH2 可下調(diào)Bcl-2 表達(dá)，因此，BACH2 可能具有治療白血病的潛在價值。

綜上所述，急性T 淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞中BACH2表達(dá)水平降低，上調(diào)BACH2表達(dá)可抑制白血病細(xì)胞的活力，并誘導(dǎo)其凋亡。