陳頤輝

(信陽農(nóng)林學院 生物與制藥工程學院，河南 信陽 464000)

多孔菌科真菌 (Polyporaceac) 隸屬于真菌界 (Fungi) 擔子菌門 (Basidiomycota) 擔子菌綱 (Basidiomycetes) 傘菌亞綱 (Agaricomycetidae) 多孔菌目 (Polyporales)[1]，自然界已知的多孔菌科真菌約有500多種，中國發(fā)現(xiàn)300余種。多孔菌科真菌是一類研究利用較多的大型真菌，擁有較高的食藥用價值，如可食用的灰樹花、地花菌、硫磺菌等；常被用作中藥材的靈芝，紫芝，茯苓、豬苓等[2]，含有較強生理活性，具有滋補、健腦等功效，且具有良好的免疫活性、抗腫瘤活性、抗氧化活性等的藥用價值[3]。

大別山地區(qū)因其富饒的植被資源和適宜的環(huán)境，蘊含豐富的多孔菌科真菌資源，各學者也有針對其中菌種的藥理活性進行研究，但相關研究多集中于對靈芝(Ganoderma Lucidum Karst)，紫芝(Ganoderma sinense)等的多糖，萜類化合物[3-4]，其他菌株與成分研究則相對較少。多孔菌科真菌的抗氧化物可作用于清除自由基，減少脂質(zhì)過氧化物的形成，增強機體抗氧化損傷的能力，防治腫瘤等[5]，同樣具有巨大的研究潛力。樹舌靈芝具有抗腫瘤、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)抗病毒等功效，云芝具有恢復和增強帶腫瘤機體的免疫功能、防癌抗癌等功效[6-7]，但其抗氧化活性的特點目前研究較少。

本研究選擇大別山地區(qū)野生樹舌靈芝和云芝作為實驗材料，以信陽農(nóng)林學院人工培養(yǎng)靈芝為對照材料，分離培養(yǎng)獲得樹舌靈芝和云芝的純種培養(yǎng)物；通過研究超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶的酶活性來探究其抗氧化活性特點，進而挖掘大別山地區(qū)多孔菌科真菌的種質(zhì)資源特點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

樹舌靈芝與云芝栓孔菌均來自于大別山區(qū)域野外采摘，選擇信陽農(nóng)林學院人工栽培靈芝為對照。二硫代對二硝甲基苯甲酸，鄰苯三酚，青霉素和鏈霉素等試劑均為分析純。

5415D微型離心機、UV752N紫外可見分光光度計、HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋、DNP電熱恒溫培養(yǎng)箱、MS105DU電子分析天平、QHZ - 98A全溫度振蕩培養(yǎng)箱。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)及粗酶液制備

將樹舌靈芝、云芝及靈芝表面沖洗干凈，再用無菌水沖洗2～3次。無菌環(huán)境下，選取菌柄和菌蓋邊緣間的中心位置，用無菌手術(shù)刀切割0.3cm左右的組織塊，壓入加有青霉素和鏈霉素的PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌落長至直徑為2～3cm時，挑選少量菌絲在PDA培養(yǎng)基上純化2～4次，將純種菌絲轉(zhuǎn)接至PDA液體培養(yǎng)基中，25℃恒溫搖床震蕩培養(yǎng)12天[8]。無菌抽濾得到菌絲體，各稱取材料0.1g，加入預先配制過的pH值7.8的0.05mol/L磷酸鈉緩沖液5mL，冰浴研磨。在4℃ 10 000r/min高速離心15min，收集上清液，隨后用以測定酶活性[9]。

1.2.2 酶活性的測定

采用鄰苯三酚自氧化法測定SOD活性[9]，參照郝俊江等[9]的方法測定CAT活性，參照王遲早等[10]的方法測定GPX活性，每組試驗重復三次，取數(shù)據(jù)平均值。

用Excel軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 超氧化物歧化酶活性

超氧化物歧化酶(SOD)是一類金屬酶,廣泛存在于生物體內(nèi)，可以特異性地催化超氧陰離子的歧化反應[11]。

由圖1可知樹舌靈芝和云芝的SOD活性均高于對照，其中云芝的SOD活性最高，達到85.40U/g，高于對照14.5%，樹舌靈芝的SOD活性同樣高于對照10.4%。

圖1 樹舌靈芝、云芝與靈芝的超氧化物歧化酶活性對比 (單位：U/g)

2.2 過氧化氫酶活性

過氧化氫酶(CAT)可以阻止H2O2與細胞中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基進一步生成羥自由基，從而防止自由基對細胞的損傷[12]。

由圖2可知實驗材料的樹舌靈芝和云芝的CAT活性均高于對照組材料，酶活性分別為38.63U/g·min，39.67U/g·min，分別高于對照6.4%、9.3%。

圖2 樹舌靈芝、云芝與靈芝的過氧化氫酶活性對比(單位：U·g-1·min-1)

2.3 谷胱甘肽過氧化物酶活性

谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)是Mills等發(fā)現(xiàn)一種自由基捕獲劑，具有很典型的抗氧化活性[11]。

由圖3可知，樹舌靈芝和云芝的GPX活性均高于對照組材料，其中樹舌靈芝的GPX活性最高，為56.79U/mL，高于對照11.0%，云芝的GPX活性53.70U/mL，同樣高于對照10.4%。

圖3 樹舌靈芝、云芝與靈芝的谷胱甘肽過氧化物酶活性對比 (單位：U/mL)

3 討論

從圖1可知，三種材料雖在同一培養(yǎng)條件下生長，但不同菌絲生長狀態(tài)不同，且根據(jù)趙丹等[11]試驗可知隨著培養(yǎng)時間的延長靈芝的SOD活性減退較快,而實驗組的SOD活性均高于對照，這說明野外采摘的樹舌靈芝和云芝具有較強的SOD活性。付欣[6-7，13]等的實驗數(shù)據(jù)可以看出，樹舌靈芝和云芝相關酶的抗腫瘤活性更大，因此也可以間接證明其所含CAT和GPX活性也相應要高。但是本實驗主要研究的是菌絲體時期的三種酶活性，根究郝俊江[7]等的研究，可以發(fā)現(xiàn)不同菌種在不同生長周期的酶活性存在差異，因此本次試驗只能證明菌絲體時期的三種酶活性差異，具體其他生長周期的SOD、CAT、GPX活性還需要進一步研究。

4 結(jié)論

本研究首次對大別山區(qū)域野生樹舌靈芝和云芝的抗氧化活性進行了研究，結(jié)果表明樹舌靈芝和云芝菌絲體的SOD、CAT和GPX酶活性均高于對照靈芝，而云芝的SOD和CAT活性又較之大于樹舌靈芝，這說明大別山區(qū)域的野生多孔菌科真菌具有良好的抗氧化活性。然而，本試驗只探究了多孔菌科真菌菌絲體某一生長階段的酶活性差異，但菌絲體不同生長時期其酶活性也存在差異，因此今后可針對菌絲體整個生長周期，甚至子實體階段的抗氧化活性進行研究。