莊英瑞， 宮相忠， 楊儒謙， 高 偉， 張 敏， 畢 萌

(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院， 山東 青島 266003)

萱藻(Scytosiphonlomentaria)隸屬于褐藻門(Phaeophyta)，系泛溫性海藻，北至加拿大丘吉爾港，南至南極洲南設(shè)得蘭群島之間的沿海海域均有分布[1-2]，在中國主要分布于遼東半島至廣東省海陵島之間的沿海海域[3-4]。萱藻是一種具有極高營養(yǎng)價(jià)值、藥用價(jià)值及生態(tài)價(jià)值的經(jīng)濟(jì)海藻[5-7]，開發(fā)潛力巨大，但受到過度采集的影響，萱藻的自然資源日漸枯竭。目前，萱藻的人工育苗技術(shù)已獲得突破，但現(xiàn)有的絲狀體擴(kuò)增主要采用三角燒瓶、廣口燒瓶和PP塑料瓶作為擴(kuò)增容器，絲狀體生長速度慢，培養(yǎng)體系光能利用率低，擴(kuò)增后期培養(yǎng)液pH過高，不但無法快速獲得足量的絲狀體，而且影響絲狀體質(zhì)量，進(jìn)而嚴(yán)重制約了萱藻工廠化育苗的規(guī)模，阻礙了萱藻養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，研究利用光生物反應(yīng)器快速擴(kuò)增萱藻絲狀體不但能提高擴(kuò)增效率，進(jìn)一步擴(kuò)大萱藻養(yǎng)殖規(guī)模，產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟(jì)效益，而且對恢復(fù)野生萱藻資源具有積極意義。

光生物反應(yīng)器的研究始于1940年代[8]，先后有開放池式、攪拌罐式、鼓泡式、管式、氣升式、平板式等形態(tài)各異的光生物反應(yīng)器被設(shè)計(jì)研發(fā)[9]。其中，氣升式光生物反應(yīng)器因其具有結(jié)構(gòu)簡單，造價(jià)低廉，操作方便，擴(kuò)增高效等優(yōu)點(diǎn)被人們廣泛應(yīng)用于微藻及大型海藻微觀藻體的培養(yǎng)。張芬芬等[10]曾報(bào)道利用自行設(shè)計(jì)的氣升式光生物反應(yīng)器擴(kuò)增小球藻(Chlorellavulagris)可將收獲的藻體干重提高157%，而張栩等[11]發(fā)現(xiàn)氣升式光生物反應(yīng)器可促進(jìn)裙帶菜(Undariapinnatifida)配子體的生長，日均增長率較常規(guī)培養(yǎng)提高了50%。

為進(jìn)一步提高氣升式光生物反應(yīng)器的擴(kuò)增效率，吳垠等[12]針對性地提出向培養(yǎng)液中補(bǔ)充CO2可解決藻類快速擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)的無機(jī)碳濃度不足的問題，實(shí)現(xiàn)藻類的高密度培養(yǎng)，而Tang等[13]亦曾報(bào)道補(bǔ)充CO2能顯著促進(jìn)斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)的生長與多不飽和脂肪酸的合成。然而，補(bǔ)充CO2雖能實(shí)現(xiàn)藻類的快速擴(kuò)增但過量的CO2會(huì)引起培養(yǎng)液pH的下降，進(jìn)而對藻類生長產(chǎn)生不利影響。楊雨玲等[14]曾報(bào)道了高濃度CO2會(huì)引起壇紫菜(Pyropiahaitanensis)絲狀體蛋白質(zhì)及色素含量的降低并造成凈光合速率的下降。

目前，適于快速擴(kuò)增萱藻絲狀體的光生物反應(yīng)器尚未見報(bào)道。因此，為探索利用氣升式光生物反應(yīng)器快速擴(kuò)增萱藻絲狀體，了解適于擴(kuò)增萱藻絲狀體的CO2補(bǔ)充量以及過量的CO2是否會(huì)對萱藻絲狀體的生長及生理產(chǎn)生影響，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了充空氣、連續(xù)充CO2與間歇充CO2三種充氣條件，探討補(bǔ)充CO2對氣升式光生物反應(yīng)器中萱藻絲狀體生長及生理的影響，并對三種充氣條件下擴(kuò)增獲得的萱藻絲狀體在孢子囊發(fā)育、孢子放散及孢子附著方面的差異做了進(jìn)一步的比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料與條件

本實(shí)驗(yàn)所用萱藻絲狀體取自中國海洋大學(xué)海藻繁殖生物學(xué)研究室種質(zhì)庫。首先將萱藻絲狀體置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行充氣培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度(21.0±0.5) ℃，光強(qiáng)40.0～54.0 μmol/m2·s，光周期14∶10 L/D，培養(yǎng)液為F1培養(yǎng)液[15]。培養(yǎng)20 d后收集萱藻絲狀體，利用組織勻漿機(jī)打碎，恢復(fù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 氣升式光生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及裝置圖

氣升式光生物反應(yīng)器由主體、導(dǎo)流筒、空氣過濾裝置、pH探針、充氣裝置等部分組成(見圖1)。反應(yīng)器主體高30.0 cm，內(nèi)徑12.0 cm，導(dǎo)流筒高13.0 cm，內(nèi)徑8.0 cm，工作體積為2.0 L。培養(yǎng)過程中整套裝置置于GXZ-300B型光照培養(yǎng)箱以控制光照強(qiáng)度、溫度和光周期。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將恢復(fù)培養(yǎng)24 h后的萱藻絲狀體接種到氣升式光生物反應(yīng)器中，接種密度為0.5 g/L，擴(kuò)增條件為溫度(21.0±0.5) ℃，光生物反應(yīng)器的表面光強(qiáng)為54.0～63.0 μmol/(m2·s)，光周期14∶10 L/D。設(shè)置三種充氣條件：空氣1.0 L/min、空氣1.0 L/min+CO21.14 mL/min和空氣1.0 L/min+間歇充CO2。間歇充CO2是由監(jiān)測及控制系統(tǒng)控制，在培養(yǎng)液pH高于8.0時(shí)開始補(bǔ)充CO2，至培養(yǎng)液pH小于7.5時(shí)結(jié)束，CO2通入速率為1.14 mL/min。其中，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)的適宜萱藻絲狀體生長的pH范圍為7.5～8.0(預(yù)實(shí)驗(yàn)所設(shè)pH條件為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示培養(yǎng)18 d，pH在7.5和8.0的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組中絲狀體生物量顯著高于其他各組，說明適宜萱藻絲狀體生長的pH范圍為7.5～8.0)。實(shí)驗(yàn)各組均設(shè)置三個(gè)平行樣。實(shí)驗(yàn)過程中每3天收集30.0 mL藻液，篩絹過濾后用吸水紙吸干表面水分，稱量萱藻絲狀體濕重并更換培養(yǎng)液。

(1.計(jì)算機(jī)；2.監(jiān)測及控制系統(tǒng)；3. pH探針；4. 排氣孔；5. 接種/取樣孔；6. 導(dǎo)流筒；7. 主體；8. 放水閥；9. 氣體分布器；10. 空氣過濾器；11. CO2流量計(jì)；12. CO2氣瓶；13. 空氣流量計(jì)；14. 充氣泵。1.Computer; 2. Monitoring and control system; 3.pH probe; 4. Air exhaust port; 5. Inoculation and sampling port; 6. Airlift column; 7. Photobioreactor; 8. Drain valve; 9. Gas sparger; 10. Air filter; 11. CO2 flowmeter; 12. CO2 cylinder;13. Air flowmeter;14. Air pump.)

萱藻絲狀體日均增長率的計(jì)算公式：

K=[( lnNt-lnN0)/t]×100% 。

式中:K代表萱藻絲狀體日均增長率；N0代表萱藻絲狀體起始生物量(g/L)；Nt代表t天時(shí)萱藻絲狀體的生物量(g/L)；t代表實(shí)驗(yàn)天數(shù)(d)。

擴(kuò)增培養(yǎng)結(jié)束后收集絲狀體，用吸水紙吸干表面水分，稱取1.0 g鮮重藻，采用氧電極法測定光合放氧和呼吸耗氧速率[16]，每個(gè)充氣條件設(shè)置3個(gè)平行樣。剩余絲狀體重新接種至氣升式光生物反應(yīng)器中進(jìn)行孢子囊誘導(dǎo)，接種密度為0.5 g/L，誘導(dǎo)條件及所用培養(yǎng)液參照高偉[15]，誘導(dǎo)過程中仍按上述三種方案充氣，誘導(dǎo)時(shí)間為18 d。實(shí)驗(yàn)各組均設(shè)置三個(gè)平行樣。誘導(dǎo)過程中每3 d更換培養(yǎng)液，誘導(dǎo)結(jié)束后統(tǒng)計(jì)孢子囊比例及直徑。

孢子囊比例=孢子囊細(xì)胞數(shù)/絲狀體細(xì)胞總數(shù)×100% 。

誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)完成后將上述經(jīng)過誘導(dǎo)的萱藻絲狀體用篩絹過濾后陰干刺激2 h，隨后分別置于20 mL滅菌海水中進(jìn)行孢子放散，放散條件參照張文健[17]。放散2 h后收集孢子液進(jìn)行觀察，取3個(gè)平行樣使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)孢子放散量。將收集的孢子液稀釋至孢子密度為1.0×104ind./mL備用。

將22 mm×22 mm蓋玻片加入至直徑90 mm的培養(yǎng)皿中，避免重疊，并向每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)加入上述備用孢子液20.0 mL，每種萱藻絲狀體取3個(gè)平行樣。附著開始后分別于第2、4、8、12、24、48 h進(jìn)行觀察，每次觀察取一片蓋玻片在400×顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野計(jì)數(shù)孢子附著量，并計(jì)算孢子附著率。

孢子附著率=附著孢子數(shù)/孢子總數(shù)×100% 。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 23.0和Excel 2016軟件進(jìn)行單因素方差分析和制圖，圖片采集及孢子囊直徑測量軟件為ISCapture。對氣升式光生物反應(yīng)器中萱藻絲狀體的生長發(fā)育拍攝顯微照片(見圖2)。

(a.擴(kuò)增18 d充空氣組萱藻絲狀體；b.擴(kuò)增18 d連續(xù)補(bǔ)充CO2組萱藻絲狀體；c.擴(kuò)增18d間歇補(bǔ)充CO2組萱藻絲狀體；d.誘導(dǎo)18 d充空氣組成熟的孢子囊；e.誘導(dǎo)18 d連續(xù)補(bǔ)充CO2組成熟的孢子囊；f.誘導(dǎo)18 d間歇補(bǔ)充CO2組成熟的孢子囊。箭頭指示成熟孢子囊。a. filaments of S. lomentaria in air-aerated group 18-day after amplification; b. filaments of S. lomentaria in continuously aerated with CO2 group 18-day after amplification; c. filaments of S. lomentaria in intermittently aerated with CO2 group 18-day after amplification; d. mature sporangia of filaments of S. lomentaria in air-aerated group 18-day after induction; e. mature sporangia of filaments of S. lomentaria in continuously aerated with CO2 group 18-day after induction; f. mature sporangia of filaments of S. lomentaria in intermittently aerated with CO2 group 18-day after induction. Arrows indicate mature sporangia.)

2 結(jié)果與分析

2.1 補(bǔ)充CO2對氣升式光生物反應(yīng)器中萱藻絲狀體生長的影響

補(bǔ)充CO2對氣升式光生物反應(yīng)器中萱藻絲狀體生長的影響如圖3所示。結(jié)果顯示補(bǔ)充CO2能顯著提高氣升式光生物反應(yīng)器中萱藻絲狀體的日均增長率。實(shí)驗(yàn)第18 d，間歇充CO2組的萱藻絲狀體日均增長率最高，為(24.15±2.34)%，顯著高于連續(xù)充CO2組與充空氣組(p<0.05)，同時(shí)連續(xù)充CO2組的日均增長率為(22.65±2.29)%，顯著高于充空氣組(p<0.05)。觀察發(fā)現(xiàn)各組萱藻絲狀體細(xì)胞質(zhì)充盈，呈褐色，絲狀體長勢良好(見圖2a～c)。

(1.充空氣組；2.連續(xù)充CO2組；3.間歇充CO2組。1.Air-aerated group；2. Continuously aerated with CO2 group；3. Intermittently aerated with CO2 group.)

2.2 補(bǔ)充CO2對氣升式光生物反應(yīng)器中萱藻絲狀體光合及呼吸作用的影響

補(bǔ)充CO2對氣升式光生物反應(yīng)器中萱藻絲狀體光合及呼吸作用的影響如圖4所示。間歇充CO2組的光合放氧速率及呼吸耗氧速率分別為(25.99±1.88)和(15.98±0.97) μmol O2·g-1FW·h-1，均顯著高于充空氣組與連續(xù)充CO2組。此外，連續(xù)充CO2組的光合放氧速率為(18.80±1.56) μmol O2·g-1FW·h-1，顯著高于充空氣組而呼吸耗氧速率僅為(10.31±2.71) μmol O2·g-1FW· h-1，與充空氣組無顯著差異。

(1.充空氣組; 2.連續(xù)充CO2組; 3.間歇充CO2組。1.Air-aerated group; 2. Continuously aerated with CO2 group; 3. Intermittently aerated with CO2 group.)

2.3 補(bǔ)充CO2對氣升式光生物反應(yīng)器中萱藻絲狀體孢子囊形成與發(fā)育的影響

各實(shí)驗(yàn)組的絲狀體均能形成發(fā)育良好的單室孢子囊且補(bǔ)充CO2有助于氣升式光生物反應(yīng)器中萱藻絲狀體單室孢子囊的形成。表1顯示，各組的初始孢子囊比例差異不顯著(p>0.05)，誘導(dǎo)18 d，補(bǔ)充CO2條件下萱藻絲狀體的單室孢子囊比例均顯著高于充空氣組(p<0.05)，且間歇充CO2組的孢子囊比例最高，為(51.03±0.78)%，說明在誘導(dǎo)孢子囊階段，適量補(bǔ)充CO2能促進(jìn)萱藻絲狀體形成孢子囊(見圖2d～f)。

表1 補(bǔ)充CO2對萱藻絲狀體孢子囊形成與發(fā)育的影響Table 1 Effects of supplementing CO2 on the formation and development of unilocular sporangia of filaments of S.lomentaria

2.4 補(bǔ)充CO2對萱藻孢子放散及附著的影響

補(bǔ)充CO2對萱藻孢子放散的影響如圖5所示。放散2 h, 補(bǔ)充CO2條件下兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組的孢子放散量均顯著高于充空氣組(p<0.05)，且間歇充CO2組的孢子放散量最高，為 (11.33±1.33)×104ind/mg FW，顯著高于連續(xù)充CO2組(p<0.05)。

(1.充空氣組; 2.連續(xù)充CO2組; 3.間歇充CO2組。1.Air-aerated group; 2. Continuously aerated with CO2 group; 3. Intermittently aerated with CO2 group.)

孢子附著結(jié)果如圖6所示。各實(shí)驗(yàn)組的孢子附著率之間無顯著差異。孢子附著48 h后，各實(shí)驗(yàn)組的孢子附著狀況良好，附著率均高于85%，其中間歇充CO2組的孢子附著率最高，為(90.67±2.40)%。

(1.充空氣組；2.連續(xù)充CO2組；3.間歇充CO2組。1.Air-aerated group；2. Continuously aerated with CO2 group；3. Intermittently aerated with CO2 group.)

3 討論

3.1 補(bǔ)充CO2對氣升式光生物反應(yīng)器中萱藻絲狀體生長及生理的影響

向光生物反應(yīng)器中通入CO2可以為藻類的光合作用提供充足的無機(jī)碳源[18]，是促進(jìn)藻類生長的有效手段。張麗莉等[18]曾報(bào)道補(bǔ)充CO2可提高小球藻在對數(shù)生長期的光合作用效率，提高生物量產(chǎn)量。徐軍田等[19]亦曾報(bào)道補(bǔ)充CO2能顯著促進(jìn)龍須菜(Gracilarialemaneiformis)的生長與藻紅蛋白的合成。在本研究中，氣升式光生物反應(yīng)器能快速擴(kuò)增萱藻絲狀體且通入CO2可提高絲狀體的光合放氧速率，進(jìn)一步促進(jìn)絲狀體的生長。通入CO2條件下擴(kuò)增18 d，間歇充CO2與連續(xù)充CO2兩組的萱藻絲狀體光合放氧速率較充空氣組分別提高了57.91%和14.24%，生物量較充空氣組分別提高了79.03%和36.74%。這說明在絲狀體的高密度培養(yǎng)中，CO2濃度是光合作用的限制因子，補(bǔ)充CO2可促進(jìn)絲狀體對光能的利用及轉(zhuǎn)化，提高光合作用效率，促進(jìn)絲狀體生長。

光合及呼吸作用是藻類生長必不可少的兩個(gè)過程，其速率直接反映了藻體代謝水平的高低進(jìn)而體現(xiàn)了生長狀況。間歇充CO2組的萱藻絲狀體光合放氧速率及呼吸耗氧速率均最高，說明在該條件下萱藻絲狀體代謝旺盛，生長狀況良好。但連續(xù)充CO2組的光合放氧速率及呼吸耗氧速率較間歇充CO2組均偏低，原因可能是過量的CO2被培養(yǎng)液吸收，造成培養(yǎng)液pH嚴(yán)重下降，阻礙了萱藻絲狀體光合及呼吸作用的正常進(jìn)行進(jìn)而影響了絲狀體的生長。測定實(shí)驗(yàn)周期中培養(yǎng)液pH的變化發(fā)現(xiàn)，連續(xù)充CO2組的pH最高僅為7.66而最低可至6.84，且除實(shí)驗(yàn)第8～11 d，其余天數(shù)pH最大值均低于7.5。與之相比，間歇充CO2組的pH最高可達(dá)8.0，且在實(shí)驗(yàn)后期需多次補(bǔ)充CO2才能滿足絲狀體光合作用的需要。因此，高濃度的CO2不僅造成了培養(yǎng)液pH的嚴(yán)重下降，而且抑制了絲狀體光合作用的正常進(jìn)行。Menéndez等[20]曾報(bào)道，過低的pH會(huì)影響藻類的光合作用，抑制光合作用的進(jìn)行，Porzio亦曾報(bào)道[21]過低的pH會(huì)影響墨角藻的CO2濃縮機(jī)制，降低碳酸酐酶活性甚至造成組織的損傷。因此，在擴(kuò)增萱藻絲狀體時(shí)應(yīng)控制CO2的通入量，使培養(yǎng)液的pH穩(wěn)定在7.5～8.0這一適宜萱藻絲狀體生長的范圍。

大型海藻對pH下降的敏感性因種類而異。Israel等[22]曾報(bào)道當(dāng)海水pH下降至7.5左右時(shí)，馬尾藻(Sargassumvulgare)的生長速率下降了50%，最大光合速率也有所下降。于娟等[23]則報(bào)道了當(dāng)pH由7.9下降至7.6時(shí)，孔石莼(Ulvapertusa)的相對增長率減少了30.28%。在本研究中，萱藻絲狀體生長的最適pH范圍為7.5～8.0，因此，與馬尾藻和孔石莼相比，萱藻絲狀體可能更適于在pH相對較低的條件下生長。

3.2 補(bǔ)充CO2對氣升式光生物反應(yīng)器中萱藻絲狀體繁殖生物學(xué)特征的影響

單室孢子囊的誘導(dǎo)以及游孢子的釋放是萱藻人工育苗過程中的重要環(huán)節(jié)。因此，要評價(jià)一種光生物反應(yīng)器是否適于擴(kuò)增萱藻絲狀體除了考慮其對萱藻絲狀體的擴(kuò)增效率外，還應(yīng)考慮擴(kuò)增獲得的萱藻絲狀體能否產(chǎn)生發(fā)育良好的單室孢子囊并釋放具有活力的游孢子[24-25]。潘雙葉[26]曾報(bào)道利用簡易氣升式光生物反應(yīng)器擴(kuò)增獲得的壇紫菜自由絲狀體可在人工誘導(dǎo)條件下正常發(fā)育為孢子囊枝，王蘭剛亦報(bào)道[27]了利用氣升式光生物反應(yīng)器可在人工誘導(dǎo)條件下實(shí)現(xiàn)條斑紫菜(Porphyrayezoensis)的自由殼孢子囊枝育苗。因此，氣升式光生物反應(yīng)器可在不影響發(fā)育的基礎(chǔ)上快速擴(kuò)增紫菜的微觀藻體。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氣升式光生物反應(yīng)器擴(kuò)增獲得的萱藻絲狀體可形成發(fā)育良好的單室孢子囊，并釋放具有活力的游孢子，完成附著過程。此外，在孢子囊誘導(dǎo)階段通入適量的CO2不但可以大幅提高萱藻絲狀體的孢子囊比例與直徑，還可提高萱藻孢子的放散量與附著率。在本研究中，間歇充CO2組的孢子囊比例及孢子放散量分別可達(dá)充空氣組的2.29倍與2.00倍，孢子附著率較充空氣組也有所提高，其原因可能是間歇充CO2組的絲狀體光合作用速率高代謝活性強(qiáng)，從而促進(jìn)了絲狀體對培養(yǎng)液中磷的吸收[28]，進(jìn)而促進(jìn)了孢子囊的發(fā)育[29]。同時(shí)，發(fā)育良好的單室孢子囊更容易集中放散游孢子，提高了孢子放散量。因此，在萱藻絲狀體的孢子囊誘導(dǎo)階段應(yīng)適量補(bǔ)充CO2以提高絲狀體的代謝水平，促進(jìn)孢子囊的發(fā)育及游孢子的釋放。

4 結(jié)語

補(bǔ)充CO2可顯著提高萱藻絲狀體的生長速率及代謝活性，促進(jìn)絲狀體生殖結(jié)構(gòu)的發(fā)育。間歇充CO2條件下萱藻絲狀體的日均增長率、光合放氧及呼吸耗氧速率均最高，生長狀況良好，代謝旺盛，且誘導(dǎo)后絲狀體的孢子囊比例、游孢子的放散量及附著率高于其他條件。連續(xù)充CO2雖然同樣可提高萱藻絲狀體的日均增長率、光合放氧速率與誘導(dǎo)后絲狀體的孢子囊比例、游孢子的放散量，但由于過量的CO2引起了培養(yǎng)液pH的嚴(yán)重下降，對上述指標(biāo)的提高效果遠(yuǎn)不如間歇充CO2。因此，間歇充CO2是適于擴(kuò)增萱藻絲狀體的CO2補(bǔ)充方式。該結(jié)果為合理補(bǔ)充CO2以實(shí)現(xiàn)萱藻絲狀體的高效擴(kuò)增提供了數(shù)據(jù)支持。