張?jiān)?，周安成，張曉彤，李紅金，劉言浩，董 健，童九翠

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 研究生學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；2.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 臨床藥學(xué)部，安徽 蕪湖 241001)

阻塞性睡眠呼吸暫停(obstructive sleep apnea,OSA)是一種呼吸系統(tǒng)疾病，表現(xiàn)為睡眠時(shí)頻繁出現(xiàn)上呼吸道部分或完全阻塞，會嚴(yán)重?fù)p害身體機(jī)能[1]。OSA在各個(gè)年齡階段均可導(dǎo)致嚴(yán)重心血管和神經(jīng)認(rèn)知疾病，被認(rèn)為是具有重大意義和高度流行的公共健康問題[2]。OSA患者在不同程度上存在神經(jīng)認(rèn)知障礙，尤其在學(xué)習(xí)理解、記憶方面[3]。研究發(fā)現(xiàn)，長期間歇性低氧大鼠的海馬組織中MDA、TNF-α、IL-1 β、IL-6含量增多，而SOD含量降低，從而會進(jìn)一步加速海馬區(qū)的細(xì)胞凋亡[4]，導(dǎo)致認(rèn)知障礙。活性氧清除劑以及藥物降低的氧化應(yīng)激和炎癥水平可以減輕長期間歇性低氧動物空間記憶缺損[5]。

豆腐果苷(helicid,HEL)是我國山龍眼科植物蘿卜樹中的天然藥物成分，目前用于減輕神經(jīng)系統(tǒng)方面的疾病[6-7]。研究表明，豆腐果苷可以改善抑郁樣大鼠的行為，減緩炎癥[8-10]。但是目前關(guān)于豆腐果苷對 OSA大鼠神經(jīng)認(rèn)知的保護(hù)研究報(bào)道甚少。豆腐果苷作為OTC藥物是否可以改善OSA引起的神經(jīng)認(rèn)知障礙和炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)旨在探索豆腐果苷能否緩解年輕OSA模型大鼠的認(rèn)知障礙以及可能潛在的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 3～4周齡、80～90 g雄性SD大鼠[南京市青龍山實(shí)驗(yàn)動物中心SCXK(蘇)2019-0043]42只。大鼠飼養(yǎng)1周以適應(yīng)新環(huán)境，光照時(shí)間12 h(7:30～20:30)，自由攝取食水，室溫(24±2)℃，每籠7只。42只大鼠隨機(jī)分為6組：正常組(control)、正常+豆腐果苷8 mg/(kg·d)(TCI Japan)組[control+HEL 8 mg/(kg·d)]、正常+豆腐果苷32 mg/(kg·d)組[control+HEL 32 mg/(kg·d)]、間歇低氧(intermittent hypoxia,IH)組、間歇低氧+豆腐果苷8 mg/(kg·d)組[IH+HEL 8 mg/(kg·d)]、間歇低氧+豆腐果苷32 mg/(kg·d)組[(IH+HEL 32 mg/(kg·d)]。整個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行6周，HEL溶解于生理鹽水中，每日7：30灌胃給藥。IH組、IH+HEL 8 mg/(kg·d)組、IH+HEL 32 mg/(kg·d)組進(jìn)行間歇低氧。

1.2 慢性間歇性低氧模型 實(shí)驗(yàn)大鼠每7只放入一個(gè)密閉箱體中(75 cm×50 cm×50 cm)，向箱內(nèi)輸入N2，使用調(diào)控系統(tǒng)，使箱內(nèi)氧氣含量在40s內(nèi)從21%降至10%，60s內(nèi)從10%升到21%，整個(gè)循環(huán)時(shí)間100 s。每天8：00～16：00，計(jì)8 h。正常組、正常+HEL[8、32 mg/(kg·d)]組不做處理。

1.3 Morris水迷宮行為檢測 定位航行實(shí)驗(yàn)中，平臺處于水下2 cm，為了讓大鼠無法看見平臺，用黑色染料將水染黑，水溫控制在(25±2)℃。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)用藍(lán)色遮光簾將周圍光源遮住，保持安靜。前4 d每只大鼠每天從四個(gè)象限指定位置背向池壁進(jìn)池。第5天檢測其逃避潛伏期。若大鼠超過60 s并未停留在平臺上，其將被引導(dǎo)至平臺上停留20 s。于第6天撤除平臺進(jìn)行空間搜索實(shí)驗(yàn)，將大鼠背向池壁沿原平臺位置對角線進(jìn)池。在60 s內(nèi)記錄大鼠的行為軌跡。

1.4 樣本采集 檢測行為學(xué)后，大鼠被腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉，取其血液和海馬組織。4℃、3000 r/min、15 min處理靜脈血，獲得血清，并置于-80℃保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。血?dú)夥治鰞x測定動脈血血氧飽和度。

1.5 ELISA檢測

1.5.1 SOD、MDA檢測 取-80℃環(huán)境下的大鼠海馬，將含有RIPA 細(xì)胞裂解液(含 PMSF)組織打碎，冰上慢搖裂解 30 min，將高速離心機(jī)設(shè)為4 ℃、1 2000 r/min、30 min，移液槍抽取上清，按照試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書檢測SOD、MDA含量。

1.5.2 炎癥因子檢測 大鼠海馬上清液、血清用IL-1β、TNF-α和IL-6(RayBiotech,Atlanta,USA)檢測試劑盒，按說明書操作測定其含量。

2 結(jié)果

2.1 HEL對間歇低氧誘導(dǎo)大鼠的血氧飽和度影響 IH組的血氧飽和度與正常組相比，血氧飽和度含量降低(P<0.001)，IH組與IH+HEL[8、32 mg/(kg·d)]組相比，藥物組的血氧飽和度含量增加(P<0.05)。正常組與正常+HEL[8、32 mg/(kg·d)]組的血氧飽和度含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=22.371,P<0.001)，見圖1。

圖1 HEL對IH誘導(dǎo)大鼠動脈血的血氧飽和度影響

2.2 HEL對間歇低氧誘導(dǎo)大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)影響 第1天各組大鼠潛伏期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說明所有組的大鼠具有相似運(yùn)動和視覺能力。測試大鼠第5天期間采集數(shù)據(jù)表明,暴露于間歇低氧試驗(yàn)動物逃避潛伏期比正常組延長(P<0.001)，IH+HEL 8 mg/(kg·d)組、IH+HEL 32 mg/(kg·d)組與IH組相比，大鼠的逃避潛伏期縮短(P<0.05)。正常組與正常+HEL[8、32 mg/(kg·d)]組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)表明HEL[8、32 mg/(kg·d)]均可以改善間歇低氧大鼠的空間記憶缺損(表1)。

表1 各組大鼠逃避潛伏期的比較 s

2.3 HEL對IH誘導(dǎo)大鼠的空間探索實(shí)驗(yàn)影響 IH和HEL均對大鼠的空間探索有明顯效果。暴露于IH大鼠到達(dá)平臺時(shí)間延長(P<0.001)，IH組大鼠與IH+HEL[8、32 mg/(kg·d)]組大鼠相比，藥物組大鼠到達(dá)平臺時(shí)間縮短(P<0.05)。正常組與正常+HEL[8、32 mg/(kg·d)]組到達(dá)平臺時(shí)間相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。暴露于IH大鼠與正常組的大鼠相比，IH大鼠探索原平臺所在象限時(shí)間減少(P<0.001)，而IH+HEL[8、32 mg/(kg·d)]組大鼠探索原平臺所在象限時(shí)間增加(P<0.05)。IH組大鼠穿越平臺位置的次數(shù)減少(P<0.001)，IH+HEL[8、32 mg/(kg·d)]組能增加大鼠穿越原平臺位置的次數(shù)(P<0.05)。正常組與正常+HEL[8、32 mg/(kg·d)]組相比，到達(dá)平臺次數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

F=16.424,P<0.001；F=48.291,P<0.001；F=5.6,P=0.001。

2.4 HEL對IH誘導(dǎo)大鼠的氧化應(yīng)激因子的效果 IH和HEL均對大鼠海馬氧化應(yīng)激因子有明顯效果。IH組MDA水平增加(P<0.001)，IH+HEL[8、32 mg/(kg·d)]組均可以降低MDA含量(P<0.05)。SOD含量在模型組中下降(P<0.001)，使用藥物低、高劑量HEL后可以增加SOD含量水平(P<0.05)。結(jié)果表明，大鼠海馬中SOD含量均可以被低、高劑量HEL升高。MDA、SOD含量差異在正常組與正常+HEL[8、32 mg/(kg·d)]組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

F=20.210,P<0.001；F=16.224,P<0.001。

2.5 HEL對IH誘導(dǎo)大鼠的炎癥因子影響 IH組血清、海馬中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均增多(P<0.001)，且IH+HEL 8 mg/(kg·d)組、IH+HEL 32 mg/(kg·d)組血清、海馬中的炎癥因子水平均比相對應(yīng)的IH組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。正常組與正常+HEL[8、32 mg/(kg·d)]組海馬、血清中的炎癥因子水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

F=133.840,P<0.001；F=36.367,P<0.001；F=81.254,P<0.001；F=35.907,P<0.001；F=45.917,P<0.001；F=22.457,P<0.001。

3 討論

隨著生活質(zhì)量提高，患有OSA兒童受到廣泛的關(guān)注，約有1%～6%的兒童患有OSA，大部分患者采用手術(shù)治療，但手術(shù)治療復(fù)發(fā)率達(dá)20%左右[11]，因此天然植物藥物如黃芪甲苷、葡萄籽原青花素、銀杏、枸杞多糖[17-20]等應(yīng)用于臨床緩解OSA癥狀，在一定程度上緩解了記憶缺損。本實(shí)驗(yàn)主要目的是探討豆腐果苷對暴露于間歇低氧年輕大鼠的治療作用及對血液和海馬組織中的炎癥因子、氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。

采用動物缺氧/復(fù)氧模式模擬OSA，了解了該疾病的許多神經(jīng)認(rèn)知和生化特征，如氧化應(yīng)激水平增加和炎癥信號激活。這些研究成果進(jìn)一步促進(jìn)對該病病理過程了解，促進(jìn)對該病治療的研究[12]。本研究的結(jié)果與先前的研究一致[13]，暴露于嚴(yán)重間歇低氧導(dǎo)致被試動物的空間記憶缺損，在行為上表現(xiàn)為逃避潛伏期延長、穿越平臺次數(shù)和停留目標(biāo)象限時(shí)間占比減少。暴露于間歇低氧并同時(shí)接受豆腐果苷治療的動物比只接受間歇低氧暴露的動物表現(xiàn)出更少的認(rèn)知和學(xué)習(xí)退化。這些效應(yīng)表現(xiàn)為脫逃潛伏期明顯縮短、穿越原平臺次數(shù)和探索目標(biāo)象限時(shí)間百分比增加，表明間歇低氧誘導(dǎo)大鼠的記憶缺損可以被豆腐果苷逆轉(zhuǎn)。

由于腦中豐富的多元不飽和脂肪酸特別容易被氧化，多種疾病會引起腦內(nèi)脂質(zhì)過度氧化，如OSA。脂質(zhì)過氧化引起細(xì)胞損傷，產(chǎn)生可擴(kuò)散的次生生物活性醛，如MDA[14]以及使SOD含量降低[15]。在患有OSA患者以及暴露于間歇低氧下大鼠，SOD和MDA含量均顯著變化[16]。本實(shí)驗(yàn)中間歇低氧誘導(dǎo)的大鼠SOD水平顯著下降，MDA表達(dá)顯著增多。用于藥物豆腐果苷后，能明顯逆轉(zhuǎn)SOD和MDA的含量，表明豆腐果苷改善氧化應(yīng)激反應(yīng)。

OSA患者血清中促炎癥因子水平(TNF-α、IL-1β、IL-6)升高，在海馬組織上有不同程度的變化[17-18]。據(jù)報(bào)道，布洛芬可以抑制暴露于間歇低氧大鼠炎癥因子過表達(dá)而改善大鼠的行為[19]。間歇低氧誘導(dǎo)的大鼠血清和海馬中促炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6均升高，豆腐果苷低、高劑量可以逆轉(zhuǎn)其促炎癥因子水平。

總之，豆腐果苷可以改善暴露于間歇低氧年輕大鼠的記憶缺損，可能通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)以及降低促炎癥因子水平，其具體機(jī)制將進(jìn)一步探索。