尹磊淼

摘要 利用表面等離子共振現(xiàn)象制備的生物傳感技術(shù)具有無(wú)標(biāo)記、靈敏度高、通量大、特異性強(qiáng)，樣品耗損少等優(yōu)點(diǎn)，在生命科學(xué)等眾多學(xué)科中得到了廣泛的關(guān)注和應(yīng)用。近年來(lái)該技術(shù)也被運(yùn)用在不少中醫(yī)藥研究的重要領(lǐng)域。本文簡(jiǎn)要介紹了表面等離子共振原理，總結(jié)并評(píng)述了在中醫(yī)藥新靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)、優(yōu)效小分子尋找等方向的研究進(jìn)展和前景。

關(guān)鍵詞 表面等離子共振;中醫(yī)藥;針灸;靶標(biāo);生物傳感器;機(jī)制研究

Abstract Biosensor technology based on surface plasmon resonance （SPR） phenomenon has been widely concerned and applied in recent years because of its advantages，such as no labeling，sensitivity，high-throughput，specificity，low sample consumption，etc.In the study of the mechanism of traditional Chinese medicine （TCM），SPR biosensor technology has also been used in many fields in recent years.In this paper，the principle of SPR is briefly introduced.The research progress and prospect in the fields，including the new target discovery of TCM and searching for small molecules with best performance，are summarized and reviewed.

Keywords Surface plasmon resonance （SPR）; Traditional Chinese medicine; Acupuncture; Target; Biosensor; Mechanism research

中圖分類號(hào)：R285.5;R2-03文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.11.008

隨著全國(guó)中醫(yī)藥大會(huì)召開(kāi)和《中共中央國(guó)務(wù)院關(guān)于促進(jìn)中醫(yī)藥傳承創(chuàng)新發(fā)展的意見(jiàn)》正式發(fā)布，我國(guó)蓬勃發(fā)展的中醫(yī)藥事業(yè)也邁入新的歷史時(shí)期[1]?？茖W(xué)化思維和工具的合理運(yùn)用對(duì)中醫(yī)藥發(fā)展十分關(guān)鍵。因此，利用新技術(shù)方法推進(jìn)并挖掘中醫(yī)、中藥蘊(yùn)含的科學(xué)機(jī)制是當(dāng)前重要任務(wù)之一[2]。目前對(duì)醫(yī)學(xué)和藥物的研究已逐漸從整體宏觀水平進(jìn)入到微觀細(xì)胞、分子水平。故確定中醫(yī)藥優(yōu)勢(shì)病種的效應(yīng)蛋白、響應(yīng)基因等分子間的相互作用，深入圍繞中醫(yī)藥關(guān)鍵靶點(diǎn)開(kāi)展特異性信號(hào)通路研究等，就成為當(dāng)前中醫(yī)藥科學(xué)機(jī)制研究的當(dāng)務(wù)之急。

基于表面等離子共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）的檢測(cè)技術(shù)是一種檢測(cè)分子間相互作用關(guān)系的無(wú)標(biāo)記、高靈敏度、高通量、特異性強(qiáng)、低耗量的生物傳感技術(shù)，是研究分子間相互作用最重要方法之一，已經(jīng)在生命科學(xué)等眾多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[3-4]。本文總結(jié)回顧了SPR原理，重點(diǎn)評(píng)述SPR技術(shù)在中醫(yī)藥新靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)及作用機(jī)制、尋找中藥優(yōu)效小分子等方面研究進(jìn)展，并對(duì)前景進(jìn)行展望。

1 SPR原理

SPR是一種物理現(xiàn)象，指當(dāng)一束光照射到鍍?cè)诓ＡП砻娴慕饘倌ど习l(fā)生全反射時(shí)，當(dāng)入射光波向量與金屬膜內(nèi)表面電子的振蕩頻率相一致時(shí)，金屬電子吸收光能發(fā)生共振，從而使得被反射光的強(qiáng)度達(dá)到最小[5-6]。而SPR生物傳感器就是利用該現(xiàn)象制備的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，可對(duì)各種生物分子間相互作用（如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-小分子、蛋白質(zhì)-核酸、核酸-核酸等）進(jìn)行檢測(cè)[7]。

在SPR生物傳感器檢測(cè)分子相互作用過(guò)程中，一般分子量較大的蛋白被固定在傳感芯片的表面（稱固定相，如中醫(yī)藥相關(guān)效應(yīng)蛋白），另一種分子在溶液流過(guò)表面（稱流動(dòng)相，如溶解的中藥有效成分），如二者有相互作用（即改變芯片表面結(jié)合的物質(zhì)質(zhì)量限度為1 pg/mm2），則導(dǎo)致表面折射率變化并引起SPR角度的變化[8]。見(jiàn)圖1。通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)上述變化不但能明確分子間是否發(fā)生特異性結(jié)合，還可精確獲得平衡解離常數(shù)（KD值，代表平衡時(shí)受體配體復(fù)合物解離程度，數(shù)值越小說(shuō)明親和力越大）等動(dòng)力學(xué)信息[9]。

2 SPR技術(shù)在中醫(yī)藥新靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)及作用機(jī)制中應(yīng)用

在中醫(yī)藥新靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)和作用機(jī)制研究方面，SPR技術(shù)對(duì)比傳統(tǒng)技術(shù)（如同位素標(biāo)記的放射配體受體分析法、基于抗體識(shí)別的免疫共沉淀方法等）常顯示出安全、快速和特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)針刺“大椎”“風(fēng)門(mén)”“肺俞”等穴位后可顯著增加哮喘模型大鼠肺組織金屬硫蛋白-2（Metallothionein-2，MT-2）蛋白水平[10]。利用Pull down方法和質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MT-2在氣管平滑肌細(xì)胞上結(jié)合蛋白是肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白-2（Transgelin-2，TG2）[11]。利用SPR技術(shù)驗(yàn)證針刺抗哮喘效應(yīng)蛋白MT-2和相應(yīng)靶標(biāo)TG2相互作用過(guò)程如下：將TG2蛋白作為固定相，依次把TG2抗體（陽(yáng)性對(duì)照）、MT-2全長(zhǎng)蛋白、MT-2的α、β亞基作為流動(dòng)相，檢測(cè)獲得MT-2和TG2蛋白的KD值為442 nmol/L，而2個(gè)亞基均無(wú)法單獨(dú)結(jié)合靶標(biāo)蛋白[12]。上述結(jié)果提示了MT-2蛋白三維結(jié)構(gòu)完整性在靶標(biāo)結(jié)合中起重要作用[12]。

SPR技術(shù)還可用于確認(rèn)中藥小分子靶點(diǎn)及其在相關(guān)疾病中作用機(jī)制。見(jiàn)表1。如牛蒡子主要成分牛蒡子苷元能夠通過(guò)增加足細(xì)胞黏附來(lái)保護(hù)高糖所致的細(xì)胞損傷，從而有效改善臨床糖尿病腎病的癥狀[13-14]。利用藥物親和反應(yīng)靶穩(wěn)定性方法（Drug Affinity Responsive Target Stability Assay）發(fā)現(xiàn)牛蒡子苷元可通過(guò)激活蛋白磷酸酶2A（Protein Phosphatase 2A，PP2A）緩解炎性反應(yīng)從而保護(hù)腎臟。利用SPR技術(shù)確認(rèn)牛蒡子苷元和PP2A存在較強(qiáng)結(jié)合，KD值為0.662 μmol/L[14]。蘇木是傳統(tǒng)活血化瘀中藥，關(guān)鍵活性成分為蘇木酮A。通過(guò)構(gòu)建帶有生物素標(biāo)記的探針，發(fā)現(xiàn)蘇木酮A發(fā)揮抗神經(jīng)炎性反應(yīng)的作用靶點(diǎn)為次黃嘌呤核苷磷酸脫氫酶（Inosine Monophosphate Dehydrogenase 2，IMPDH2），利用SPR技術(shù)檢測(cè)蘇木酮A和IMPDH2靶標(biāo)的KD值為3.944 nmol/L[15]。小檗堿是從黃連等中草藥中提取分離得到的一類異喹啉類生物堿，具有抗炎、調(diào)節(jié)脂肪代謝等多種藥理作用，然而相應(yīng)生物學(xué)機(jī)制仍然不清楚[16]。利用Discovery Studio 2017 R2反向篩選小檗堿的潛在靶點(diǎn)是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2，VEGFR2），經(jīng)SPR技術(shù)確認(rèn)小檗堿和VEGFR2在體外有良好的結(jié)合，KD值為0.65 μmol/L[17]。應(yīng)用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（Forster Resonance Energy Transfer，F(xiàn)RET），從23個(gè)小分子中篩選出小檗堿是潛在的凝血酶抑制劑，兩者特異性結(jié)合KD值為16.39 μmol/L[18]。果膠是人參主要有效成分之一，人參果膠RG-I-4能夠特異性地與半乳凝集素-3的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域結(jié)合來(lái)抑制活性，KD值為22.2 nmol/L[19]。研究發(fā)現(xiàn)齊墩果酸等三萜類天然產(chǎn)物能夠和埃博拉等病毒的膜蛋白HR2結(jié)構(gòu)域結(jié)合，實(shí)現(xiàn)光譜抗感染作用。SPR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物Y11可和HR2結(jié)合，KD值為5.4 μmol/L[20]。甘草成分之一芹糖甘草苷能夠激活TGF/p38MAPK通路提高鹽皮質(zhì)激素受體蛋白表達(dá)，SPR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)芹糖甘草苷和鹽皮質(zhì)激素受體結(jié)合KD值為0.11 μmol/L[21]。

3 SPR技術(shù)在尋找優(yōu)化中藥小分子中應(yīng)用

新藥研發(fā)過(guò)程中，針對(duì)靶標(biāo)蛋白的活性化合物篩選尤為關(guān)鍵。中藥具有經(jīng)過(guò)臨床驗(yàn)證的良好功效且不良反應(yīng)小，是有效化合物篩選的理想來(lái)源之一[22]。而SPR技術(shù)通量高（常規(guī)96孔或384孔進(jìn)樣）、特異性強(qiáng)，對(duì)于候選小分子純度、溶解度（可含10%DMSO）要求不高，因此可以顯著地提高分析效率[23]。SPR技術(shù)和中藥分子庫(kù)結(jié)合有效突破了傳統(tǒng)藥篩方法制約，減小篩選盲目性和工作量，提高藥物篩選效率和成功率[24]。

應(yīng)用SPR技術(shù)可通過(guò)檢測(cè)靶標(biāo)和小分子相互作用的KD值大小來(lái)快速篩選先導(dǎo)化合物。如針對(duì)炎性反應(yīng)遞質(zhì)半胱氨酰白三烯合成的限速酶5-脂氧酶（5-lipoxygenase），通過(guò)分子對(duì)接和藥效團(tuán)構(gòu)建模塊進(jìn)行計(jì)算機(jī)虛擬篩選后，利用SPR技術(shù)確認(rèn)來(lái)源于17種中藥的11個(gè)黃酮類小分子能與5-脂氧酶結(jié)合[25]。以人表皮生長(zhǎng)因子受體（Epithelial Growth Factor Receptor，EGFR）為靶標(biāo)，利用SPR技術(shù)從新疆紫草所含的4種柰醌類活性成分中篩選出一種潛在的EGFR抑制劑2β-二甲基丙烯酰紫草素，KD值為2.31 μmol/L[26]。通過(guò)SPR技術(shù)分析確認(rèn)結(jié)合小分子的作用方式和共性規(guī)律，上述結(jié)果均為開(kāi)發(fā)靶向5-脂氧酶或EGFR的新藥研發(fā)提供思路和方法。

SPR技術(shù)還可通過(guò)和質(zhì)譜等技術(shù)共同配合，快速篩選相應(yīng)小分子。針對(duì)核受體超家族的核心成員維甲酸X受體α（Retinoid X Receptor α），將中藥淫羊藿抗炎活性餾分與該靶標(biāo)蛋白共同孵育，利用含His標(biāo)簽的重組蛋白進(jìn)行Pull down捕獲結(jié)合小分子，進(jìn)一步利用高效液相色譜儀、核磁和質(zhì)譜識(shí)別作用分子[27]。最終利用SPR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)寶藿苷I和維甲酸X受體α能夠結(jié)合，KD值為8.6 μmol/L[27]。將腫瘤壞死因子受體1（Tumor Necrosis Factor Receptor Type 1）做固定相，篩選獲得有結(jié)合小分子后，利用質(zhì)譜確認(rèn)為大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷，KD值為376 nmol/L[28]。針對(duì)乳腺癌新靶標(biāo)14-3-3τ蛋白，先通過(guò)液相色譜-熒光檢測(cè)方法進(jìn)行篩選，從82個(gè)不同類別的天然化合物中獲得苯乙醇苷類等17種化合物，通過(guò)SRP技術(shù)確認(rèn)齊墩果酸、牛蒡子苷等10個(gè)特異性結(jié)合化合物[29]。分別將脂多糖和含胞嘧啶-磷酸鹽-鳥(niǎo)嘌呤基序的寡脫氧核苷酸（CpG DNA）固定在SPR芯片上，從114種中藥候選小分子中發(fā)現(xiàn)地骨皮乙素是有效的脂多糖和CpG DNA雙靶點(diǎn)抑制劑[30]。

4 SPR技術(shù)在中藥小分子藥代動(dòng)力學(xué)研究中應(yīng)用

在藥代動(dòng)力學(xué)研究方面，血清白蛋白對(duì)藥物小分子的吸收、結(jié)合起著關(guān)鍵作用。以SPR技術(shù)為核心的檢測(cè)平臺(tái)從黃芩中快速篩選出了針對(duì)人血清白蛋白的11個(gè)異黃酮類小分子和9個(gè)黃芪皂苷類小分子[31]。利用SPR技術(shù)平臺(tái)將人血清白蛋白固定在檢測(cè)芯片表面，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)紫草素KD值為21.24 μmol/L[32]。牛磺熊去氧膽酸鈉與牛血清白蛋白存在確定的相互作用，KD值為0.547 μmol/L[33]。雙黃連注射液中的4種類黃酮（黃芩素、黃芩苷、燈盞花乙素和白楊素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷）均能夠和牛血清白蛋白結(jié)合，KD值范圍在（4～30）×10-4 M[34]。上述結(jié)果均有助于提示紫草素、?；切苋パ跄懰徕c等中藥小分子可和血清白蛋白有效結(jié)合，從而借助血清白蛋白運(yùn)輸?shù)竭_(dá)作用靶點(diǎn)。基于SPR技術(shù)的藥代動(dòng)力學(xué)特性評(píng)價(jià)可以有效補(bǔ)充相關(guān)中藥小分子與其藥理靶點(diǎn)相互作用關(guān)系。

5 總結(jié)和展望

中醫(yī)藥是一個(gè)復(fù)雜的體系，但常常由于效應(yīng)物質(zhì)和作用靶點(diǎn)不明確而難以深入揭示其治療疾病的分子機(jī)制[35]?！肮び破涫拢叵壤淦鳌?。以SPR為代表的各種生物傳感技術(shù)以其無(wú)標(biāo)記、靈敏度高、篩選通量大、特異性強(qiáng)，耗損少等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為中醫(yī)藥機(jī)制研究中的重要工具之一。目前SPR技術(shù)已經(jīng)在中醫(yī)藥新靶標(biāo)和潛在作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)、優(yōu)效中藥小分子尋找等多方面獲得了不錯(cuò)的成績(jī)。結(jié)合確有臨床療效的中醫(yī)藥方法，也隨著SPR技術(shù)本身的不斷發(fā)展與完善，相信必將在今后的中醫(yī)藥機(jī)制研究中有更廣泛的應(yīng)用。

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（2020-05-10收稿 責(zé)任編輯：徐穎）