李捷　唐勇　劉潔

摘要 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)是在單個(gè)細(xì)胞水平上，對(duì)基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀組進(jìn)行高通量測(cè)序的新技術(shù)，能夠揭示單個(gè)細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)狀態(tài)，是研究細(xì)胞異質(zhì)性的有力工具。近十年來涌現(xiàn)出大量基于這項(xiàng)技術(shù)的生物細(xì)胞異質(zhì)性研究，應(yīng)用于腫瘤學(xué)、胚胎發(fā)育、神經(jīng)生物學(xué)、免疫學(xué)等多個(gè)研究領(lǐng)域。在中醫(yī)藥領(lǐng)域科研中剛開始嶄露頭角，已經(jīng)有利用單細(xì)胞測(cè)序進(jìn)行中醫(yī)方劑、中藥作用機(jī)制等的科學(xué)研究。通過介紹單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)概況以及現(xiàn)階段在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究中的應(yīng)用，論述單細(xì)胞測(cè)序在中醫(yī)學(xué)研究中的可應(yīng)用方向，拓展中醫(yī)研究思路和方法，為探索中醫(yī)藥的現(xiàn)代化研究提供了新的支撐，大大加快傳統(tǒng)中醫(yī)藥與現(xiàn)代生命科學(xué)技術(shù)的結(jié)合。

關(guān)鍵詞 單細(xì)胞測(cè)序概述;單細(xì)胞測(cè)序應(yīng)用;方藥作用機(jī)制;中醫(yī)診斷原理;針灸作用機(jī)制

Abstract Single-cell sequencing technology is a new technique for high-throughput sequencing of genome，transcriptome and epigenome at the level of a single cell.It can reveal the gene structure and gene expression state of a single cell，and is a powerful tool for the study of cell heterogeneity.In the past decade，a large number of researches on biological cell heterogeneity based on this technology have emerged，which have been applied in oncology，embryonic development，neurobiology，immunology and other research fields.In the field of traditional Chinese medicine（TCM） scientific research is just beginning to emerge，there has been the use of single cell sequencing of prescriptions，the mechanism of action of traditional Chinese medicine and other scientific research.Through the introduction of single-celled sequencing technology and its application at present in the field of medical research，discusses the single-celled sequencing in TCM can be used in the study of the direction，to expand the research ideas and methods of TCM，to explore the modernization of TCM research provides new support，greatly accelerate the combination of TCM and modern life science and technology.

Keywords Single cell sequencing overview; Single cell sequencing application; Prescription mechanism; Diagnosis principle of TCM; Acupuncture mechanism

中圖分類號(hào)：R2-03文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.11.001

中醫(yī)藥是我國(guó)傳承了五千年的瑰寶，它的療效及其科學(xué)性經(jīng)住了歷史長(zhǎng)河的考驗(yàn)，但是由于中醫(yī)藥的理論和作用機(jī)制很多都尚不明確，導(dǎo)致中醫(yī)藥還未被世界完全認(rèn)可，甚至有很多國(guó)人都不信任中醫(yī)藥，所以把現(xiàn)代先進(jìn)科學(xué)技術(shù)與中醫(yī)藥相結(jié)合，進(jìn)一步探索中醫(yī)藥理論作用機(jī)制是發(fā)揚(yáng)中醫(yī)的重要一環(huán)?，F(xiàn)代科學(xué)對(duì)于生命的認(rèn)識(shí)從群體、個(gè)體、器官組織水平一直發(fā)展到目前的細(xì)胞水平乃至分子生物學(xué)水平，其研究是一個(gè)從宏觀到微觀，從現(xiàn)象到本質(zhì)逐層深入的過程。隨著基因組計(jì)劃以及一代、二代轉(zhuǎn)錄組研究在器官、組織水平的開展，單細(xì)胞水平的基因組和轉(zhuǎn)錄組研究逐漸成為關(guān)注焦點(diǎn)。在中醫(yī)藥領(lǐng)域研究中，隨著分子生物學(xué)前沿技術(shù)的大量應(yīng)用，人們已經(jīng)從多層次、多角度對(duì)中醫(yī)學(xué)的辨治理論及方藥的作用機(jī)制等進(jìn)行了深入探討，取得了眾多令人矚目的研究成果。近年來單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于中醫(yī)藥研究，已經(jīng)解決了部分中醫(yī)科研中遇到的難題。本文介紹了單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)及在各個(gè)領(lǐng)域中的發(fā)現(xiàn)，例舉其在中醫(yī)藥研究的應(yīng)用和探索，討論了未來中醫(yī)與單細(xì)胞技術(shù)結(jié)合的思路。

1 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)

1.1 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)概述

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)是指對(duì)單細(xì)胞基因組或轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，從而獲得基因組、轉(zhuǎn)錄組或其他多組學(xué)信息，以揭示細(xì)胞群體差異和細(xì)胞進(jìn)化關(guān)系。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)主要包括單細(xì)胞基因組測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和表觀遺傳學(xué)測(cè)序，它們各自有各自的特點(diǎn)，滿足了多種科研需求。2009年，Tang等[1]首次通過改進(jìn)先前用于微陣列分析的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增方法，分析了來自小鼠四細(xì)胞胚胎階段的單個(gè)卵裂球的轉(zhuǎn)錄組。2011年，Islam等[2]建立了單細(xì)胞標(biāo)記的逆轉(zhuǎn)錄測(cè)序方法，即STRT-seq（Single-cell Tagged Reverse Transcription Sequencing），能夠大規(guī)模檢測(cè)各種混合細(xì)胞樣本。在此之后，2012年，Ramskold等[3]開發(fā)了一種新的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)Smart-seq（Switching Mechanism at 5′ end of the RNA Transcript），檢測(cè)來自單細(xì)胞水平的RNA和單個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的全長(zhǎng)mRNA，增加了轉(zhuǎn)錄本序列的覆蓋度。2013年，《科學(xué)》（Science）雜志將單細(xì)胞測(cè)序列為年度最值得關(guān)注的六大領(lǐng)域榜首，《自然方法》雜志將單細(xì)胞測(cè)序的應(yīng)用列為年度最重要的方法學(xué)進(jìn)展[4]。2014年，Jaitin等[5]建立了名為MARS-seq（Massively Parallel Single Cell RNA-seq）單細(xì)胞測(cè)序的方法，該方法可用于分析數(shù)千個(gè)單個(gè)細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。2015年，哈佛醫(yī)學(xué)院的研究人員將微流控技術(shù)結(jié)合納升級(jí)液滴和條碼微珠，推出Drop-seq[6]和inDrop[7]技術(shù)，微珠直接捕獲mRNA，全部反應(yīng)均在一個(gè)液滴中完成，產(chǎn)物濃度更高，且成本大大降低。2017年，Gierahn等[8]提出10xGemCode技術(shù)，該技術(shù)將條碼反應(yīng)液滴以油滴封裝，反轉(zhuǎn)效率更高，可實(shí)現(xiàn)數(shù)千個(gè)免疫細(xì)胞的分析。2018年，Han等[9]開發(fā)的Microwell-seq是一個(gè)高吞吐量、低成本的scRNA-seq平臺(tái)，提高了單細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)的豐度，但與涂有油滴的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)相比，它也降低了一個(gè)數(shù)量級(jí)的檢測(cè)成本。Rosenberg等[10]的SPLit-seq技術(shù)基于低成本組合條形碼的原理可對(duì)數(shù)十萬個(gè)細(xì)胞直接捕獲，不需要將單個(gè)細(xì)胞用油滴包裹形成獨(dú)立的單元極大簡(jiǎn)化了步驟和節(jié)約了成本，實(shí)現(xiàn)每個(gè)細(xì)胞檢測(cè)成本小于1美分。直到今天單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)更加準(zhǔn)確、高效、多元化、低成本。到今天，單細(xì)胞測(cè)序已經(jīng)廣泛用于癌癥、胚胎發(fā)育、神經(jīng)生物學(xué)和免疫學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域并取得了重大的突破。

1.2 單細(xì)胞測(cè)序類型

1.2.1 單細(xì)胞全基因組測(cè)序

單細(xì)胞基因組測(cè)序是從分離的單細(xì)胞中提取DNA后，擴(kuò)增單細(xì)胞的全基因組，通過第二代DNA測(cè)序技術(shù)進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序分析[11]。這種測(cè)序技術(shù)主要用于發(fā)現(xiàn)DNA分子水平的異常。不僅可以發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)的突變，并且可以鑒定突變伴隨的細(xì)胞亞群，從而為疾病治療提供更特異的靶點(diǎn)[12]。首先是Navin等[13]通過流式細(xì)胞分離，對(duì)200個(gè)癌細(xì)胞分別進(jìn)行單細(xì)胞全基因組測(cè)序，研究癌癥的進(jìn)化，發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞分化過程中的異質(zhì)性。后來Yang等[14]分別從一名46歲外源性型宮頸癌患者的新鮮腫瘤組織中采集了放療前和放療后的宮頸細(xì)胞，對(duì)每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞全基因組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)放療前和放療后的腫瘤細(xì)胞幾乎是2個(gè)獨(dú)立的克隆，放療前的主要亞群被殺死，放療前的次要亞群成為放療后的主要亞群。放射治療后，在腫瘤細(xì)胞中POU class 5 homeobox 1B（POU5F1B）中檢測(cè)到人乳頭瘤病毒（HPV）融合位點(diǎn)。結(jié)果表明，在POU5F1B中整合HPV的腫瘤細(xì)胞在放療后存活，放療前后腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的特征。這些結(jié)果為研究驅(qū)動(dòng)宮頸癌放療耐藥的具體分子事件提供了新的思路。

1.2.2 單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是從分離出的單細(xì)胞中進(jìn)行單細(xì)胞分離和RNA提取后，需要先將捕獲到的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后通過PCR或其他轉(zhuǎn)錄方法對(duì)整個(gè)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行擴(kuò)增[8]。該技術(shù)在揭示細(xì)胞類型、確定細(xì)胞亞群、準(zhǔn)確反映細(xì)胞間的異質(zhì)性、描述細(xì)胞命運(yùn)譜系等方面發(fā)揮了重要作用[15]。Paul等[16]發(fā)表在細(xì)胞（Cell）雜志上的工作，利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)υ缙谒柘底婕?xì)胞群體進(jìn)行分析，將傳統(tǒng)定義的共同髓系祖細(xì)胞及其下游的粒系-單核系祖細(xì)胞和巨核-紅系祖細(xì)胞詳細(xì)劃分為18種亞群，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞、單核細(xì)胞等下游細(xì)胞均具有不同程度的轉(zhuǎn)錄特異性。近期Dominguez等[17]利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)，在動(dòng)物模型中繪制了胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）進(jìn)展過程中的成纖維細(xì)胞結(jié)構(gòu)，通過轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子和表達(dá)含有15（LRRC15）蛋白的富含亮氨酸的重復(fù)序列，確定了一組癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）。LRRC15* CAFs存在于22例PDAC患者的>80.000個(gè)單細(xì)胞和70例患者的免疫組織化學(xué)標(biāo)本中，均證實(shí)了LRRC15* CAFs存在于人類患者中。此外。由6種癌癥類型的600多名患者參與的免疫治療臨床試驗(yàn)顯示，LRRC15* CAF的表達(dá)水平升高與抗pd-l1治療的不良反應(yīng)有關(guān)。這項(xiàng)工作對(duì)于靶向腫瘤微環(huán)境的非免疫元件以促進(jìn)癌癥患者對(duì)免疫檢查點(diǎn)阻斷治療的反應(yīng)具有重要的意義。

1.2.3 單細(xì)胞表觀基因組測(cè)序

表觀基因組測(cè)序主要針對(duì)DNA修飾和DNA甲基化和組蛋白修飾等方面進(jìn)行研究，表觀基因組測(cè)序可以探索稀有細(xì)胞類型的表觀基因組變化并破解細(xì)胞群體中的表觀遺傳異質(zhì)性[18]。Nagano等[19]的Hi-C法是最先被提出的單細(xì)胞表觀基因組測(cè)序方法，可在百萬堿基分辨率的基礎(chǔ)上識(shí)別單細(xì)胞水平的染色體相互作測(cè)序，引入單細(xì)胞Hi-C，結(jié)合全基因組的統(tǒng)計(jì)分析和單拷貝X染色體的結(jié)構(gòu)建模，以表明單個(gè)染色體在巨堿基尺度上保持區(qū)域組織，但在更大的尺度上顯示可變的細(xì)胞間染色體結(jié)構(gòu)，單細(xì)胞Hi-C數(shù)據(jù)在染色體基因組學(xué)和顯微學(xué)研究之間架起了橋梁，展示了動(dòng)態(tài)染色體結(jié)構(gòu)下的模塊化組織，以及這種結(jié)構(gòu)與基因組活動(dòng)模式之間的概率聯(lián)系。隨后，Guo等[20]用單細(xì)胞亞硫酸鹽測(cè)序法（scRRBS）可以檢測(cè)到單個(gè)小鼠胚胎干細(xì)胞（mESC）基因組中多達(dá)150萬個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，還可以檢測(cè)單倍體精子細(xì)胞中單個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，無論是未甲基化的還是完全甲基化的。此外，還發(fā)現(xiàn)，在小鼠受精卵的個(gè)體前核內(nèi)，可以追蹤到受精后母體和父方基因組的去甲基化動(dòng)力學(xué)，無論在雄性還是雌性原核中，基因區(qū)域的去甲基化過程都比基因間區(qū)域的去甲基化過程快。這種方法為探索單個(gè)細(xì)胞在胚胎發(fā)育等生理過程或腫瘤發(fā)生等病理過程中的單堿基分辨率的動(dòng)態(tài)甲基化環(huán)境鋪平了道路。

1.2.4 單細(xì)胞多組學(xué)測(cè)序

近年來，單細(xì)胞技術(shù)使多組同步測(cè)序成為現(xiàn)實(shí)，這有助于更詳細(xì)地闡明單個(gè)細(xì)胞的基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組之間的關(guān)系。單細(xì)胞三重組學(xué)測(cè)序是利用單個(gè)細(xì)胞釋放到上清液中的mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。然后，用單細(xì)胞還原表征亞硫酸氫鹽測(cè)序法在含有基因組DNA的沉淀中檢測(cè)DNA甲基化序列和基因拷貝數(shù)的變化。最后，可以同時(shí)獲得單細(xì)胞基因組、轉(zhuǎn)錄組和DNA甲基化模式的數(shù)據(jù)以及它們之間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系[21]。如Hou等[22]利用單細(xì)胞多組學(xué)測(cè)序，同時(shí)分析單個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組拷貝數(shù)變異（CNVs）、DNA甲基化組和轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)，大規(guī)模的拷貝數(shù)變異會(huì)導(dǎo)致獲得或丟失基因組區(qū)域內(nèi)基因RNA表達(dá)的比例變化，而這些拷貝數(shù)變異通常不會(huì)影響這些區(qū)域的DNA甲基化。此外，將單細(xì)胞多組學(xué)測(cè)序應(yīng)用于25個(gè)來源于人肝細(xì)胞癌組織樣本的癌細(xì)胞，根據(jù)CNVs、DNA甲基化組或單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組鑒定了這些細(xì)胞中的2個(gè)亞群。單細(xì)胞多組學(xué)測(cè)序在單細(xì)胞水平上同時(shí)詢問其組成成分的基因組、甲基化組和轉(zhuǎn)錄組，成為破解發(fā)育和癌癥中細(xì)胞群的異質(zhì)性和復(fù)雜性的有力工具。單細(xì)胞多組學(xué)測(cè)序也可以用來研究腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。近期Bain等[23]優(yōu)化單細(xì)胞多組學(xué)測(cè)序研究人類結(jié)直腸癌細(xì)胞，全基因組的DNA甲基化水平在單個(gè)遺傳亞系中相對(duì)一致，然后對(duì)10例直腸癌患者的DNA進(jìn)行了測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其癌細(xì)胞的全基因組DNA去甲基化模式是一致的。癌細(xì)胞DNA去甲基化程度與正常組織中異染色質(zhì)相關(guān)組蛋白修飾H3K9me3的密度和重復(fù)元素長(zhǎng)時(shí)間穿插的核元素1的密度明顯相關(guān)，提示DNA甲基化譜在單一遺傳譜系或次世代內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤DNA甲基化水平的差異可能主要是由亞家族成分的差異引起的，而非轉(zhuǎn)移過程中的去甲基化或去甲基化。由此可以證明用單細(xì)胞多組學(xué)測(cè)序重建遺傳譜系和追蹤其表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組動(dòng)力學(xué)的可行性。

1.3 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)基本流程

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)是近年來迅速發(fā)展的生命科學(xué)前沿技術(shù)，它在單細(xì)胞水平揭示細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)狀態(tài)，反映細(xì)胞間的異質(zhì)性具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，為生命科學(xué)的研究打開了新的大門。該技術(shù)一般流程可分為單細(xì)胞分離、核酸擴(kuò)增、高通量測(cè)序、數(shù)據(jù)分析這幾個(gè)步驟[24-25]。簡(jiǎn)要流程見圖1。

2 單細(xì)胞測(cè)序在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用

2.1 腫瘤

首先應(yīng)用最廣的是腫瘤方向的研究，在腫瘤研究中的應(yīng)用表明，遺傳或基因組變異可導(dǎo)致腫瘤組織內(nèi)具有不同遺傳和表型特征的細(xì)胞，使腫瘤組織具有高度異質(zhì)性。這種高度的異質(zhì)性可能與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的機(jī)制有關(guān)[26-31]，傳統(tǒng)的測(cè)序方法只能檢測(cè)到細(xì)胞的數(shù)量，得到一組細(xì)胞的平均信號(hào)，掩蓋腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可以很好的彌補(bǔ)傳統(tǒng)測(cè)序方法的不足，通過檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，繪制腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞圖譜，進(jìn)一步明確腫瘤組織內(nèi)的細(xì)胞群，尋找特異性標(biāo)志物，解釋腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移等一系列問題。最早Navin等[13]使用單細(xì)胞mRNA測(cè)序（scRNA-seq）了解乳腺癌的起源首次單核測(cè)序分析基因組拷貝數(shù)變異，研究2例乳腺癌患者的腫瘤種群結(jié)構(gòu)和進(jìn)化。結(jié)果在腫瘤中發(fā)現(xiàn)了間斷的克隆進(jìn)化，并證實(shí)了轉(zhuǎn)移細(xì)胞是從主要的晚期擴(kuò)展中出現(xiàn)的。近期，Zhang等[31]對(duì)結(jié)直腸癌患者的免疫和基質(zhì)人群進(jìn)行了scRNA-seq分析，確定了特異性巨噬細(xì)胞和常規(guī)樹突狀細(xì)胞（cDC）亞群作為腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞串音的關(guān)鍵遞質(zhì)。在小鼠腫瘤中定義可比較的髓細(xì)胞群，能夠表征它們對(duì)髓細(xì)胞靶向免疫治療的反應(yīng)。他們使用抗csf1r的具有炎性反應(yīng)信號(hào)的優(yōu)先耗竭巨噬細(xì)胞進(jìn)行治療，但保留小鼠和人類中表達(dá)促血管生成/致瘤基因的巨噬細(xì)胞群，CD40激動(dòng)劑抗體的治療優(yōu)先激活cDC人群，增加Bhlhe40類th1細(xì)胞和CD8記憶T細(xì)胞。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)對(duì)人和小鼠關(guān)鍵的骨髓亞群的綜合分析確定了調(diào)節(jié)腫瘤免疫的關(guān)鍵細(xì)胞相互作用，并確定了髓樣靶向免疫治療的機(jī)制。綜上所述，單細(xì)胞測(cè)序在探究腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

2.2 生殖和胚胎醫(yī)學(xué)

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可以在單細(xì)胞水平上對(duì)生殖細(xì)胞和胚胎細(xì)胞的全基因組進(jìn)行測(cè)序和定量，這將有助于了解生殖細(xì)胞的發(fā)生以及生殖和遺傳疾病的篩查、診斷和治療。單細(xì)胞測(cè)序用于生殖和胚胎發(fā)育領(lǐng)域在鑒定細(xì)胞類型、探究細(xì)胞異質(zhì)性、推斷細(xì)胞發(fā)育軌跡方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。例如Vento-Tormo等[32]用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)對(duì)妊娠早期胎盤細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，并繪制了胎盤細(xì)胞圖譜。通過細(xì)胞圖譜發(fā)現(xiàn)了位于不同蛻膜層和蛻膜自然殺傷細(xì)胞的血管周細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的3個(gè)亞群，且具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)和趨化特性，揭示了蛻膜和胎盤的細(xì)胞組織，以及對(duì)胎盤形成和生殖成功至關(guān)重要的相互作用。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)了解早期妊娠過程有重要意義。

2.3 神經(jīng)生物學(xué)

在神經(jīng)系統(tǒng)中，單個(gè)神經(jīng)元之間存在差異，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可以研究許多不同時(shí)期的神經(jīng)細(xì)胞，并繪制詳細(xì)的單細(xì)胞圖，以了解和識(shí)別大腦中不同類型的神經(jīng)元及其連接分子[33]。如Luo等[34]通過高通量單細(xì)胞甲基化測(cè)序?qū)⑿∈蠛腿祟愵~葉皮層神經(jīng)元細(xì)胞的亞型分化。他們?cè)谌祟愵~葉皮層中發(fā)現(xiàn)了一組新的神經(jīng)元，并基于神經(jīng)元的甲基化組重新定義了神經(jīng)元類型。近期Perlman等[35]分析了包括髓鞘形成高峰時(shí)間在內(nèi)的不同年齡段的人類腦組織，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)不同的細(xì)胞亞群，包括早期OPC（e-OPC）組、晚期OPC組（l-OPC）和成熟的OL（MOL）組，并將具有階段特異性功能的少突細(xì)胞譜系細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征聯(lián)系起來，豐富了e-OPCs的基因本體論術(shù)語包括細(xì)胞周期和發(fā)育，l-OPCs包括細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞黏附，而MOLs包括髓鞘化和細(xì)胞骨架。e-OPCs多局限于早幼粒細(xì)胞形成的胎兒組，l-OPCs多見于兒童年齡組，與早幼粒細(xì)胞形成的高峰年齡相對(duì)應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了醇系細(xì)胞在髓鞘形成高峰之前、期間和之后的轉(zhuǎn)錄組變異性，有助于識(shí)別實(shí)現(xiàn)髓鞘形成所需的新途徑。綜上所述，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)是研究神經(jīng)細(xì)胞種類，發(fā)育、再生、分化的有力工具。

2.4 免疫學(xué)

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可以幫助我們探索生理和病理狀態(tài)下免疫細(xì)胞狀態(tài)和分化軌跡。Stewart等[36]使用單細(xì)胞測(cè)序描繪了人類腎臟的時(shí)空免疫拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，揭示了上皮細(xì)胞內(nèi)免疫基因的解剖學(xué)定義的表達(dá)模式，在胎兒和成熟的腎臟中，組織內(nèi)存在的髓樣和淋巴樣免疫細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)都是明顯的，并且在出生后，上皮免疫協(xié)同抗菌巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞定位于腎臟最易感染的區(qū)域，轉(zhuǎn)錄程序的獲得促進(jìn)了感染防御能力，進(jìn)一步完善了人類腎臟的免疫系統(tǒng)是如何分區(qū)以應(yīng)對(duì)免疫挑戰(zhàn)的概覽。Reyes等[37]發(fā)現(xiàn)了敗血癥患者的免疫細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)變化，利用單細(xì)胞RNA測(cè)序來分析膿毒癥患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs，106 545個(gè)細(xì)胞）和樹突狀細(xì)胞（19 806個(gè)細(xì)胞），并根據(jù)它們的基因表達(dá)譜聚類，定義了16種免疫細(xì)胞狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)了一種獨(dú)特的CD14單核細(xì)胞狀態(tài)，這種狀態(tài)在膿毒癥患者中得到了擴(kuò)展，確定了一組用于分離和定量單核細(xì)胞狀態(tài)的表面標(biāo)記，并對(duì)其表觀基因組和功能表型進(jìn)行了表征，并提出了一個(gè)從人類骨髓誘導(dǎo)單核細(xì)胞狀態(tài)的模型。這項(xiàng)研究證明了單細(xì)胞基因組學(xué)在發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)的細(xì)胞學(xué)特征方面的實(shí)用價(jià)值，并為深入了解細(xì)菌敗血癥免疫失調(diào)的細(xì)胞基礎(chǔ)提供了思路。

以上列舉了單細(xì)胞測(cè)序應(yīng)用最廣泛的幾個(gè)領(lǐng)域，近年來，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展不僅促進(jìn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展，也廣泛用于微生物學(xué)、農(nóng)林牧漁等，大大推進(jìn)了生命科學(xué)的發(fā)展進(jìn)程。作為“在單個(gè)細(xì)胞水平上對(duì)基因組進(jìn)行測(cè)序”的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)能夠解決傳統(tǒng)測(cè)序的下列難題：1）能得到每個(gè)細(xì)胞所獨(dú)有的特質(zhì); 2）可以研究難以在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)擴(kuò)大，樣品量又不能滿足全基因組測(cè)序分析的要求的樣本，例如腫瘤循環(huán)細(xì)胞、組織微陣列、早期發(fā)育的胚胎細(xì)胞等; 3）能檢測(cè)到微量的基因表達(dá)了罕見非編碼RNA[38]。其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)開啟了生命科學(xué)探索的新天地。

3 單細(xì)胞測(cè)序在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用

結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的科研思路，利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的優(yōu)勢(shì)可以從單個(gè)細(xì)胞水平闡明中醫(yī)學(xué)方藥、針灸等的作用機(jī)制的難題，為中醫(yī)藥研究提供新的探索思路。

3.1 單細(xì)胞測(cè)序在中醫(yī)復(fù)方作用機(jī)制的應(yīng)用

中醫(yī)臨床治療疾病，以中藥復(fù)方為主要手段。實(shí)踐證明，大多數(shù)疾病的療效，是通過大量中藥有效成分來發(fā)揮作用的，因此不能通過傳統(tǒng)的單靶標(biāo)藥物篩選來研究中藥有效成分，而應(yīng)從多靶點(diǎn)的研究策略出發(fā)。長(zhǎng)期以來，由于中藥復(fù)方成分過于復(fù)雜，為其機(jī)制研究帶來很大難度。中藥復(fù)方的作用是對(duì)人體整體的證候狀況而采用的整體調(diào)節(jié)，實(shí)質(zhì)上也最終對(duì)基因組的整體作用[39]。利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可以解決一些復(fù)方機(jī)制研究的限制。如Liang Q等[40]證明左歸丸可改變能量代謝基因的表達(dá)，防止高糖小鼠胚胎細(xì)胞死亡。他們發(fā)現(xiàn)左歸丸對(duì)成人及其后代的糖耐量受損（IGT）都有益處，但是其作用機(jī)制尚不明確。把所有受精卵隨機(jī)分為3組：對(duì)照組、模型組和藥物組。每組9個(gè)受精卵。各組受精卵的培養(yǎng)培養(yǎng)基為：對(duì)照組采用細(xì)胞培養(yǎng)基，模型組采用補(bǔ)充高糖15.6 mmol/L的細(xì)胞培養(yǎng)基，藥物組采用與模型組相似但添加了含0.01% v/v左歸丸的大鼠血清的培養(yǎng)基，體外培養(yǎng)五天后（2-細(xì)胞期胚胎），采用顯微操作技術(shù)單細(xì)胞分離，進(jìn)行單細(xì)胞RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。用DESeq2進(jìn)行差異基因表達(dá)分析，結(jié)果，高糖可以下調(diào)核糖體通路的基因，而左歸丸可以逆轉(zhuǎn)這種下調(diào)，從而防止高糖引起的胚胎細(xì)胞死亡。此外，高糖可影響糖代謝，影響線粒體功能，而左歸丸主要通過三羧酸循環(huán)上調(diào)呼吸鏈基因和氧化磷酸化促進(jìn)糖代謝從而對(duì)葡萄糖負(fù)荷引起的胚胎細(xì)胞死亡有保護(hù)作用。單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)不僅揭示了高糖影響2-細(xì)胞期胚胎的基因調(diào)控變化，而且為深入了解左歸丸在糖耐量受損模型上的潛在分子機(jī)制提供了思路。

3.2 單細(xì)胞測(cè)序應(yīng)用于中藥作用機(jī)制的研究

幾千年的中醫(yī)藥學(xué)有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但受到有效成分及作用機(jī)制不明確等因素影響而不能被西醫(yī)體系所普遍接受。因此，在中藥研究方面，篩選治療疾病的有效藥物并探討其作用機(jī)制歷來是其重要內(nèi)容。目前，由于出現(xiàn)了系統(tǒng)的多靶點(diǎn)藥物設(shè)計(jì)策略，全球?qū)鹘y(tǒng)草藥的興趣有所增加。中藥成分、相應(yīng)的蛋白靶點(diǎn)、靶點(diǎn)參與的生物過程、藥物靶點(diǎn)相互作用和靶點(diǎn)-靶點(diǎn)相互作用是了解中藥分子機(jī)制的必要條件。

單細(xì)胞測(cè)序完善了各類相關(guān)數(shù)據(jù)庫。由于基于網(wǎng)絡(luò)的多靶點(diǎn)藥物設(shè)計(jì)方法可以整合不同平臺(tái)上的相關(guān)信息，因此，它們將更有助對(duì)比分析出中藥治療疾病的作用機(jī)制。Sun Y等[41]以阿爾茨海默?。ˋD）中草藥研究為例，通過對(duì)臨床試驗(yàn)抗AD中草藥的研究，論證了基于網(wǎng)絡(luò)的中醫(yī)不同數(shù)據(jù)源整合的價(jià)值，提示雪蓮可能主要通過改善癥狀的方式產(chǎn)生抗阿爾茲海默作用，而丹參的作用靶點(diǎn)主要參與炎性反應(yīng)和癌相關(guān)通路，銀杏在這些的基本途徑中靶點(diǎn)分布更為多樣化，表明其抗阿爾茲海默作用更為廣泛。

單細(xì)胞測(cè)序在中藥物種鑒定、種質(zhì)資源開發(fā)和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系等方面的研究也具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如：Ai H L等[42]利用單細(xì)胞測(cè)序和基因組裝算法[43]的出常見中藥射干的完整的質(zhì)體基因組。瓜蔞，是治療各種疾病的基本中藥。Yang等[44]研究已經(jīng)確定了該菌葉綠體基因組的完整序列?？偦蚪M長(zhǎng)度為157 481 bp，包含一對(duì)26 268 bp的反向重復(fù)序列（IRs），分別被大單拷貝（LSC）和小單拷貝（SSC）分離，分別為86 478 bp和18 467 bp。共預(yù)測(cè)130個(gè)基因，其中蛋白編碼基因85個(gè)，rRNA基因8個(gè)，tRNA基因37個(gè)。進(jìn)一步的系統(tǒng)發(fā)育分析證實(shí)了天牛屬葫蘆科。其完整的葉綠體基因組將在植物系統(tǒng)發(fā)育和種群遺傳研究的分子標(biāo)記開發(fā)中發(fā)揮重要作用?；诰W(wǎng)絡(luò)的各種數(shù)據(jù)庫和組學(xué)數(shù)據(jù)的整合，這不僅有助于對(duì)疾病發(fā)病機(jī)制的整體理解，而且為今后中藥在藥物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用提供了新的線索。

4 小結(jié)

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)是在單個(gè)細(xì)胞水平上，對(duì)基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀組進(jìn)行高通量測(cè)序的新技術(shù)，能夠揭示單個(gè)細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)狀態(tài)。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用是一個(gè)特別值得探索的領(lǐng)域，對(duì)細(xì)胞的異質(zhì)性的研究能夠解決中醫(yī)藥科研上的某些難題。目前中醫(yī)藥領(lǐng)域已經(jīng)有利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)對(duì)中藥、方劑的作用機(jī)制的探索。將技術(shù)方法與傳統(tǒng)中醫(yī)藥研究有機(jī)結(jié)合，在中醫(yī)藥基礎(chǔ)和臨床研究的思路與方法上有所創(chuàng)新，隨著技術(shù)的進(jìn)步和成熟，將會(huì)對(duì)中醫(yī)藥研究帶來重大突破。利用現(xiàn)代的新技術(shù)為傳統(tǒng)的中醫(yī)學(xué)抽象的理論尋找物質(zhì)基礎(chǔ)，可大大加快中醫(yī)學(xué)被現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和全世界接受的進(jìn)程。

5 討論

目前，單細(xì)胞測(cè)序在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用還非常少，但是卻有巨大的發(fā)展?jié)摿?，我們可以從其他領(lǐng)域的研究成果中獲得靈感，探索中醫(yī)藥未知的領(lǐng)域。例如：

5.1 中醫(yī)診斷學(xué)

中醫(yī)診斷學(xué)是根據(jù)中醫(yī)學(xué)的理論，研究診察病情、判斷病種、辨別證候的基礎(chǔ)理論、基本知識(shí)和基本技能的一門學(xué)科，中醫(yī)辨證論治是中醫(yī)診斷學(xué)重要的組成部分，但是辨證論治原理需要用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)來證明其科學(xué)性。以中醫(yī)辨證治療骨關(guān)節(jié)炎為例：骨關(guān)節(jié)炎在中醫(yī)屬“痹癥”范疇，中醫(yī)將骨性關(guān)節(jié)炎辨證分為四型，分別是：風(fēng)寒濕痹、氣血瘀阻、濕熱痹阻和肝腎虧虛?？梢岳脝渭?xì)胞測(cè)序來探究不同證型的分子生物學(xué)依據(jù)。參考Quanbo等[45]對(duì)骨關(guān)節(jié)炎（OA）患者的軟骨細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、分析，使用嚴(yán)重程度指數(shù)和對(duì)應(yīng)分析研究了OA景觀的轉(zhuǎn)錄計(jì)劃與臨床結(jié)果之間的關(guān)系，得出了關(guān)于臨床結(jié)果的預(yù)測(cè)指標(biāo)，明確了不同細(xì)胞類型在OA早期診斷和治療中的作用，病變的滑膜組織相對(duì)于正?；そM織之間，以及不同疾病的滑膜組織之間，其組成的細(xì)胞群類型是有區(qū)別的，可以通過對(duì)不同時(shí)期的不同的細(xì)胞類型進(jìn)行測(cè)序分析，得到不同時(shí)期滑膜中具有特異性基因表達(dá)的不同細(xì)胞群，從而對(duì)疾病進(jìn)行分期，了解疾病不同時(shí)期的差異性表達(dá)的結(jié)果。如果將其應(yīng)用于一個(gè)大的患者群體中，單細(xì)胞測(cè)序還可以揭示功能性病理標(biāo)記，從而區(qū)分疾病不同的臨床軌跡和治療反應(yīng)[46-47]。同樣，我們將單細(xì)胞測(cè)序用于中醫(yī)辨證分型的研究，不僅能闡釋其科學(xué)性，還能使其更加規(guī)范化與標(biāo)準(zhǔn)化。

5.2 方藥、針灸等治療疾病的機(jī)制研究

中醫(yī)內(nèi)服的湯劑、外治針灸療法對(duì)各個(gè)系統(tǒng)的疾病均有明顯的臨床療效，但是由于其作用機(jī)制與靶點(diǎn)尚不明確，加上治療手段沒有標(biāo)準(zhǔn)化，這些問題成為中醫(yī)走向世界的阻礙?，F(xiàn)代科學(xué)技術(shù)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)與中醫(yī)相結(jié)合，進(jìn)一步促進(jìn)中醫(yī)藥機(jī)制研究，以腫瘤防治為例：從中藥中提取分離得到的抗腫瘤成分，包括三尖杉?jí)A、紫杉醇、羥基喜樹堿和長(zhǎng)春堿類等，已經(jīng)成為療效明確的抗腫瘤藥物[48]。參考Guo等[49]對(duì)來自14個(gè)藥物治療前非小細(xì)胞肺癌患者的外周血、癌旁組織和癌組織中T細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，描繪了已知的免疫治療靶點(diǎn)基因在不同T細(xì)胞亞群中的表達(dá)分布，揭示了不同的免疫治療藥物可能靶向的細(xì)胞類群。中醫(yī)藥治療手段的靶點(diǎn)和機(jī)制等研究，可以利用單細(xì)胞測(cè)序來實(shí)現(xiàn)。

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)用于中醫(yī)藥研究仍然存在一定的局限，該技術(shù)操作復(fù)雜而且成本較高，高擴(kuò)增偏倚、低準(zhǔn)確度。目前階段能夠檢測(cè)的細(xì)胞數(shù)量受到一定限制，因此難以避免不同樣本、個(gè)體以及不同研究間存在數(shù)據(jù)偏差。希望隨著技術(shù)的優(yōu)化，標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一以及樣本量的增加，這種偏差逐漸減小。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)必然會(huì)更加高效、高保真、低成本。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)為中醫(yī)藥研究領(lǐng)域揭開新的篇章，我們相信隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的不斷優(yōu)化，多組學(xué)研究的結(jié)合以及時(shí)空層面的多維應(yīng)用，為中醫(yī)機(jī)制的探索提供了有力的支持。如果我們有計(jì)算工具可以整合基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、微生物組學(xué)、藥物基因組學(xué)和臨床樣本的相關(guān)信息，這些數(shù)據(jù)將更有助于在分子網(wǎng)絡(luò)的背景下理解中醫(yī)的整體、互補(bǔ)和協(xié)同本質(zhì)，將大大加快中醫(yī)藥走向世界的進(jìn)程。

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（2020-05-10收稿 責(zé)任編輯：徐穎）