林思思　阿列克謝·沃瑞克哈特斯基　唐勇

摘要 雙光子顯微鏡作為現(xiàn)代最重要的光學(xué)顯微鏡技術(shù)，具有3D成像、在體成像、光漂白和光毒性低等特點(diǎn)。該技術(shù)已被運(yùn)用到與中醫(yī)藥相關(guān)的細(xì)胞成像、組織成像和在體成像研究中，為中醫(yī)藥治療相關(guān)疾病提供更科學(xué)和直觀的理論依據(jù)。本文對(duì)現(xiàn)有的雙光子顯微鏡技術(shù)在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)行概述，以期為中醫(yī)藥研究提供新方向。

關(guān)鍵詞 雙光子顯微鏡;中醫(yī)藥;細(xì)胞成像;組織成像;在體成像

Application of Two-photon Microscopy in the Field of Traditional Chinese Medicine

LIN Sisi1，Alexei Verkhratsky1，2，TANG Yong1，3

（1 College of Acupuncture and Tuina，Chengdu University of TCM，Chengdu 610075，China; 2 The University of Manchester，Manchester M139PL，United Kingdom; 3 Key Laboratory of Sichuan Province for Acupuncture and Chronobiology，Chengdu 610075，China）

Abstract Two-photon microscope，as the most important optical microscope technology，showed remarkable advantages of 3D imaging，in vivo imaging，photobleaching and low phototoxicity.It has been utilized in cell imaging，tissue imaging and in vivo imaging related to traditional Chinese medicine （TCM） to provide a more scientific and intuitive theoretical basis for the treatment of related diseases by TCM.This paper summarizes the application research of the existing two-photon microscope technology in the field of TCM，in the hope of providing new directions for the research of TCM.

Keywords Two-photon microscope; Traditional Chinese medicine; Cell imaging; Tissue imaging; In-vivo imaging

中圖分類號(hào)：R2-03文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.11.002

雙光子顯微鏡是現(xiàn)代重要的光學(xué)顯微鏡，具有3D成像、活體動(dòng)物成像、檢測(cè)靈敏度高、空間定位性高、光漂白和光損傷低等特點(diǎn)，在生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域中廣泛運(yùn)用。中醫(yī)藥是我國(guó)歷史悠久且具有獨(dú)特理論及技術(shù)方法的醫(yī)學(xué)體系，在治療臨床疾病中發(fā)揮著不可或缺的作用。中醫(yī)藥領(lǐng)域已經(jīng)開展了大量中醫(yī)藥臨床與基礎(chǔ)研究，來(lái)闡述中醫(yī)藥治療的作用及機(jī)制。目前最大的問(wèn)題是創(chuàng)新性和準(zhǔn)確性不足，因此結(jié)合現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)是推動(dòng)中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展的關(guān)鍵。雙光子顯微鏡在中醫(yī)藥研究中的細(xì)胞成像、組織成像、在體成像中得到廣泛運(yùn)用，使中醫(yī)藥研究實(shí)現(xiàn)“可視化”創(chuàng)新，提供了更科學(xué)、更直觀的證據(jù)。本文對(duì)雙光子顯微鏡技術(shù)發(fā)展和優(yōu)勢(shì)，以及其在中醫(yī)藥領(lǐng)域的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)、組織結(jié)構(gòu)、活體成像等方面的應(yīng)用進(jìn)行闡述，并展望其更廣闊的應(yīng)用前景。

1 雙光子顯微鏡技術(shù)簡(jiǎn)介

1.1 雙光子顯微鏡的發(fā)展

1990年，Denk等[1]將雙光子激發(fā)現(xiàn)象應(yīng)用到熒光顯微鏡中，發(fā)明了第一臺(tái)雙光子顯微鏡。初代的雙光子顯微鏡在技術(shù)方面有單一成像、采集頻率不足、體積較大等缺點(diǎn)。近年來(lái)，為了突破單一成像的技術(shù)限制，Jérme Lecoq[2]團(tuán)隊(duì)在2014年研發(fā)出一種可以同時(shí)在大腦2個(gè)區(qū)域進(jìn)行成像的雙光子顯微鏡，可以觀察小鼠2個(gè)腦區(qū)之間的相互作用。其后Mengke Yang等[3]研發(fā)了一種多區(qū)域的雙光子實(shí)時(shí)體內(nèi)探索器，這種探索器可以很容易對(duì)體內(nèi)多區(qū)域神經(jīng)元進(jìn)行探索，可以研究全腦的神經(jīng)環(huán)路。Daniel Barson[4]團(tuán)隊(duì)最新研發(fā)出一種可以同時(shí)觀察局部神經(jīng)元功能和整個(gè)大腦網(wǎng)絡(luò)的正交軸顯微鏡，其中介觀顯微鏡位于大腦上方，雙光子物鏡則位于水平方向，這樣可以同時(shí)進(jìn)行介觀和雙光子成像。這種方法也能夠識(shí)別遠(yuǎn)距離皮層網(wǎng)絡(luò)的椎體神經(jīng)元和表達(dá)血管活性腸肽的中間神經(jīng)元的行為狀態(tài)相關(guān)的功能連接。為了更好地監(jiān)視神經(jīng)元的活動(dòng)，了解大腦中的信息處理過(guò)程，Jianglai Wu等[5]研發(fā)出一種每秒高達(dá)3 000幀和亞微米的空間分辨率成像的雙光子顯微鏡，該設(shè)備可以檢測(cè)固定的清醒小鼠大腦表面以下345 μm的超閾值和亞閾值電活動(dòng)。Tong Zhang[6]團(tuán)隊(duì)相繼研發(fā)了一個(gè)具有400個(gè)照明光束的雙光子顯微鏡，該顯微鏡以高達(dá)1 kHz的速率共同采集95 000～211 000 μm2的區(qū)域，可以在清醒小鼠的大腦中觀察到微循環(huán)血流、快速靜脈收縮和神經(jīng)元鈣離子的增高，并具有毫秒級(jí)的定時(shí)分辨率。而為了使雙光子吸收更有效，Tomoaki Kinjo等[7]研發(fā)出一種名為2paCRY2的CRY2變體，該蛋白可以通過(guò)藍(lán)色熒光蛋白的共振能量轉(zhuǎn)移被雙光子激發(fā)更有效的激活，使雙光子激發(fā)效率更高。

以上的技術(shù)發(fā)展都使雙光子顯微鏡在成像速度更快、分辨率更高和激發(fā)更有效等方面提高。而從傳統(tǒng)的雙光子顯微鏡發(fā)展到微型雙光子顯微鏡更是使該技術(shù)得到質(zhì)的飛躍。雙光子顯微鏡創(chuàng)始人Denk[8]團(tuán)隊(duì)在2001年研制出第一代的微型雙光子顯微鏡，為該方向奠定了理論基礎(chǔ)。接著各個(gè)研究團(tuán)隊(duì)在微型雙光子顯微鏡的分辨率和頭戴重量等相關(guān)技術(shù)上不斷改進(jìn)更新[9-10]。2017北京大學(xué)的程和平院士團(tuán)隊(duì)[11]研制出新一代的微型雙光子顯微鏡。見(jiàn)圖1。該團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了新型920 nm空心光子晶體光纖和高速雙軸微機(jī)電掃描儀等最新配件，最重要的是該微型雙光子顯微鏡重量只有2.2 g，可以實(shí)現(xiàn)多探頭佩戴和多顱窗不同腦區(qū)的長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)測(cè)。并且這種微型雙光子顯微鏡能研究更多樣的動(dòng)物行為，例如親子護(hù)理、社交等社交行為或者進(jìn)食和睡眠等自然行為。

雙光子吸收是指在強(qiáng)光激發(fā)下，遞質(zhì)分子吸收第一個(gè)光子達(dá)到虛能級(jí)之后，在飛秒時(shí)間內(nèi)收第二個(gè)光子，獲得足夠的能量，從而躍遷到達(dá)激發(fā)態(tài)的過(guò)程。雙光子吸收是目前在生物學(xué)標(biāo)本中應(yīng)用最為廣泛的非線性光學(xué)效應(yīng)。由于具有這種特殊的光學(xué)效應(yīng)，雙光子顯微鏡已經(jīng)被運(yùn)用到各個(gè)領(lǐng)域，包括從分子到網(wǎng)絡(luò)，細(xì)胞到組織，離體到在體以及生理病理等多個(gè)層次。從細(xì)胞成像開始，Philippe Bousso等[12]通過(guò)雙光子顯微鏡對(duì)胸腺培養(yǎng)物中的胸腺細(xì)胞發(fā)育和細(xì)胞接觸進(jìn)行了實(shí)時(shí)分析。接著，利用雙光子顯微鏡技術(shù)具有成像深度深和光毒性低的特點(diǎn)，MichaelD.Cahalan等[13]發(fā)現(xiàn)雙光子顯微鏡與指示劑分子的結(jié)合可以闡釋淋巴器官組織中的T細(xì)胞和B細(xì)胞的編排，可以揭示免疫應(yīng)答基礎(chǔ)的細(xì)胞協(xié)同作用。Jing W.Wang等[14]則在2003年運(yùn)用雙光子顯微鏡結(jié)合鈣成像技術(shù)揭示了果蠅中可以被氣味激活的大腦活動(dòng)圖譜。從此，雙光子在體成像技術(shù)更多運(yùn)用到神經(jīng)科學(xué)的領(lǐng)域。在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞成像中，有研究發(fā)現(xiàn)聽覺(jué)感覺(jué)皮層中神經(jīng)元組的回聲反應(yīng)優(yōu)先發(fā)生在接近神經(jīng)元最佳頻率的的地方[15]，還有研究建立了長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)測(cè)清醒獼猴的皮層神經(jīng)元鈣信號(hào)[16]，另有研究發(fā)現(xiàn)胡須刺激和微脈管刺激會(huì)影響皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的鈣離子信號(hào)[17-18]。在樹突和樹突棘成像方面，北京大學(xué)深圳研究生院的甘文標(biāo)團(tuán)隊(duì)首次用雙光子顯微鏡證明了大腦皮質(zhì)的大部分樹突棘穩(wěn)定存在于生命過(guò)程[19]。該團(tuán)隊(duì)在后續(xù)的研究中還證明大腦皮質(zhì)的樹突棘是作為長(zhǎng)期信息存儲(chǔ)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[20-23]。雙光子顯微鏡還可用于監(jiān)測(cè)小鼠皮層中間神經(jīng)元的樹突形態(tài)[24]。在血管成像中，結(jié)合熒光標(biāo)記技術(shù)可以將老鼠耳朵皮膚深度超過(guò)100 μm的3D血管清晰地顯示出來(lái)，從而提供整個(gè)血管網(wǎng)絡(luò)的信息[25]。

除上述應(yīng)用以外，近年來(lái)雙光子顯微鏡還與光遺傳、化學(xué)遺傳和光纖記錄等技術(shù)在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域被廣泛結(jié)合運(yùn)用。例如結(jié)合光纖記錄技術(shù)，在雙光子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)抗抑郁藥物可能通過(guò)選擇修復(fù)前額葉皮質(zhì)的樹突棘發(fā)揮作用[26]。利用光遺傳學(xué)原理，用雙光子顯微鏡本身的激光對(duì)神經(jīng)環(huán)路進(jìn)行閉環(huán)刺激，可以實(shí)現(xiàn)在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中“實(shí)時(shí)”操縱神經(jīng)環(huán)路[27];對(duì)眼額葉皮質(zhì)的有關(guān)喂養(yǎng)和社交的神經(jīng)元進(jìn)行5秒的光刺激可以促進(jìn)喂養(yǎng)和社交行為[28]。結(jié)合化學(xué)遺傳技術(shù)，研究發(fā)現(xiàn)社會(huì)刺激可以誘導(dǎo)下丘腦室旁核內(nèi)催產(chǎn)素神經(jīng)元的激活，以促進(jìn)雄性小鼠的社會(huì)行為[29]。

1.2 雙光子顯微鏡的特性與優(yōu)勢(shì)

雙光子顯微鏡在細(xì)胞成像、組織成像和在體成像研究中都具有不同的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)。見(jiàn)圖2。對(duì)于細(xì)胞成像來(lái)說(shuō)，典型的雙光子腦部系統(tǒng)通常能夠達(dá)到亞微米級(jí)的空間分辨率，能夠滿足細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)的成像的研究[30]。例如用追蹤單個(gè)細(xì)胞的方法了解嗅球中的球旁細(xì)胞的遷移過(guò)程[31]。在組織成像研究中，光毒性和光漂白性低對(duì)于組織來(lái)說(shuō)十分重要。雙光子的激發(fā)發(fā)生在焦點(diǎn)附近，使其激發(fā)光可以穿透更深的標(biāo)本，同時(shí)光毒性和光漂白性也低。這種特性適合于進(jìn)行各部分組織結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)研究[32]。例如，有研究將其運(yùn)用于觀察基底細(xì)胞癌和惡性黑色素瘤等不同病變皮膚的形態(tài)學(xué)特征[33];有研究發(fā)現(xiàn)子宮黏膜中的CD8+常駐記憶細(xì)胞可以獨(dú)立于局部記憶或者淋巴組織增生而自主調(diào)節(jié)局部免疫監(jiān)測(cè)[34]。在活體成像研究中，雙光子顯微鏡系統(tǒng)通常采用波長(zhǎng)較長(zhǎng)的紅外激光作為激發(fā)光源，這種光源的波長(zhǎng)在生物組織中具有較好的穿透性，可以達(dá)到數(shù)百微米的成像深度[35]。所以它可以在活體內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)分子事件的動(dòng)態(tài)、實(shí)時(shí)、連續(xù)監(jiān)測(cè)，并且能夠揭示生物分子的相互作用過(guò)程的時(shí)間、空間關(guān)系[36]。適用于上述列舉的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞成像、樹突和樹突棘成像和血管成像等。

2 雙光子成像技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用

目前，雙光子顯微鏡技術(shù)在中醫(yī)藥研究中已經(jīng)涵蓋了細(xì)胞、組織及活體成像。見(jiàn)表1。

在細(xì)胞成像研究中，發(fā)現(xiàn)相關(guān)的中藥大分子可以促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，為中醫(yī)藥治療癌癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在組織成像研究中，雙光子顯微鏡觀察中藥提取物和方劑對(duì)腎臟、肝臟、腸組織的影響，結(jié)果顯示中藥提取物和方劑可以有效改善腎小球腎炎、肝纖維化、慢性炎性腸病等臨床疾病。為了更準(zhǔn)確闡釋中醫(yī)藥治療疾病的臨床療效，相關(guān)的活體動(dòng)物研究是必不可少的。在活體成像研究中，研究者運(yùn)用雙光子顯微鏡觀察中藥提取物和方劑對(duì)腦血管疾病和阿爾茲海默癥疾病模型的影響，明確了中醫(yī)藥在腦血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用，同時(shí)，也證明針灸可以升高穴位附近肌肉的Ca2+水平。下面將從細(xì)胞成像、組織成像、活體成像3個(gè)方面論述雙光子顯微鏡在中醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。

2.1 中醫(yī)藥應(yīng)用中的細(xì)胞成像

利用雙光子顯微鏡進(jìn)行的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)成像具有以下4個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1）具有單細(xì)胞甚至亞細(xì)胞分辨率;2）可以同時(shí)記錄到上百甚至更多個(gè)神經(jīng)細(xì)胞的活動(dòng);3）能夠明確記錄每個(gè)細(xì)胞的相對(duì)位置以及細(xì)胞類型;4）結(jié)合電生理方法，可以將神經(jīng)元的活動(dòng)精確到單個(gè)動(dòng)作電位[39]。因此雙光子顯微鏡技術(shù)被廣泛運(yùn)用到中藥、方劑等相關(guān)的細(xì)胞研究中。

中藥在臨床上治療癌癥時(shí)有很好的療效，但是各類中藥主要的作用成分和機(jī)制還不夠明確。雙光子顯微鏡在中藥研究中的最早應(yīng)用是研究天花粉蛋白對(duì)人絨癌細(xì)胞的作用。天花粉蛋白是從中草藥瓜蔞根中提取的一種核糖體失活蛋白，具有抗腫瘤和抗HIV作用。張春陽(yáng)等[40]應(yīng)用雙光子顯微鏡結(jié)合特異性熒光探針首次觀察到天花粉蛋白誘導(dǎo)人絨癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中活性氧自由基和細(xì)胞內(nèi)鈣離子的變化。結(jié)果顯示天花粉蛋白誘導(dǎo)的鈣離子升高和自由基的形成參與了其誘導(dǎo)人絨癌細(xì)胞的凋亡過(guò)程，且自由基的形成與鈣離子升高有關(guān)。該研究也為后續(xù)中醫(yī)藥領(lǐng)域的細(xì)胞研究建立了一種在單細(xì)胞層次適時(shí)、無(wú)損傷、多參數(shù)觀察活細(xì)胞的方法。接著，在相關(guān)中藥誘導(dǎo)癌細(xì)胞的后續(xù)研究中，繆冬映[41]發(fā)現(xiàn)中藥苦參、山豆根等的主要成分苦參堿能夠通過(guò)抑制重要的信號(hào)通路，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)，并且能夠誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。其研究應(yīng)用雙光子顯微鏡觀察細(xì)胞的凋亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入苦參堿后結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)在不同時(shí)間點(diǎn)均出現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)抑制，并隨著藥物濃度的提高和時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。

2.2 中醫(yī)藥應(yīng)用中的組織成像

雙光子顯微鏡組織成像的標(biāo)本有很多種類，例如腎、肝、心、腸和腦等。同時(shí)雙光子顯微鏡所需的特殊激發(fā)光可以控制分子熒光開關(guān)技術(shù)用于活體熒光成像，從而獲得焦平面15 nm的分辨率，對(duì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)有很好的分辨率，而其極低的組織損傷也使得很多生物過(guò)程得以長(zhǎng)時(shí)間觀察，是中醫(yī)藥研究組織形態(tài)學(xué)的一大優(yōu)勢(shì)[42]。

苦豆子是一味具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕療效的中藥，常用于治療痢疾、濕瘡等疾病。氧化苦參堿是從中藥苦豆子中提取的成分，是苦參堿的N-氧化物。柴寧莉等[43]運(yùn)用雙光子顯微鏡技術(shù)觀察經(jīng)尾靜脈注射紅色熒光蛋白標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞8周后的肝臟組織，發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合觀察組的肝臟脂肪變和纖維化程度減輕，肝細(xì)胞脂肪變和壞死較輕。同時(shí)檢測(cè)血清發(fā)現(xiàn)聯(lián)合觀察組的ALT、AST水平也更低。結(jié)果表明氧化苦參堿協(xié)同骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝纖維化的效果優(yōu)于這2種藥物單獨(dú)使用，且未出現(xiàn)不良反應(yīng)，這給臨床治療肝纖維化提供新的途徑。同樣，雷公藤作為治療風(fēng)濕頑痹的要藥，在現(xiàn)代臨床中也常用于治療腎小球腎炎、腎病綜合征等腎臟疾病。雷公藤甲素是雷公藤中最重要的活性成分，在雷公藤治療腎病的機(jī)制中成為研究熱點(diǎn)[44]。李亞妤等[45]先后在2個(gè)研究中證實(shí)了雷公藤甲素對(duì)局灶節(jié)段硬化性腎小球腎炎（FSGS）的治療效果以及相關(guān)的機(jī)制。2個(gè)研究中采用切除5/6腎制備FSGS模型，均分為雷公藤低、中、高劑量組和模型組。研究通過(guò)觀察各組大鼠一般情況和尿蛋白定量變化以及在雙光子顯微鏡下觀察腎組織病理形態(tài)等指標(biāo)，結(jié)果顯示雷公藤甲素可以明顯增加FSGS大鼠總體生存率，而組織切片雷公藤甲素各組與對(duì)照組相比大鼠腎皮質(zhì)uPAR、β3整合素表達(dá)增強(qiáng)，且高劑量組優(yōu)于低劑量組。該研究中還發(fā)現(xiàn)μPAR和β3整合素對(duì)足細(xì)胞損傷具有調(diào)控作用，而足細(xì)胞損傷在FSGS疾病中發(fā)揮了重要的作用，所以該觀察組再后面的研究主要證實(shí)Synaptopodin蛋白在雷公藤甲素治療FSGS的作用。同樣通過(guò)雙光子顯微鏡觀察疾病模型大鼠的腎臟組織切片病理形態(tài)變化及尿蛋白等指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素確能減少FSGS腎病大鼠模型24 h尿蛋白定量以及保護(hù)腎功能。而相關(guān)機(jī)制與雷公藤甲素能上調(diào)Synaptopodin蛋白的表達(dá)，減少腎組織足細(xì)胞的損傷有關(guān)[46]。

方劑在中醫(yī)藥治療疾病的效果十分顯著，但是同樣在機(jī)制方面缺乏直接的科學(xué)證據(jù)。雙光子顯微鏡在經(jīng)方的研究中也發(fā)揮著重要的作用。參苓白術(shù)散是《太平惠民和濟(jì)局方》中的名方，主要治證由脾虛致濕所致。在已證實(shí)參苓白術(shù)散可以減輕慢性炎性腸?。↖BD）癥狀，同時(shí)可以改善腸上皮黏膜屏障的基礎(chǔ)上，游宇等[47]通過(guò)雙光子顯微鏡觀察IBD小鼠模型的腸組織切片的自噬及相關(guān)蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)參苓白術(shù)散明顯改善IBD小鼠的隱血、便血和病理改變等，且增加腸上皮細(xì)胞的自噬，進(jìn)一步證實(shí)參苓白術(shù)散抗IBD的作用與其調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞的自噬有關(guān)。

2.3 中醫(yī)藥應(yīng)用的活體成像

活體光學(xué)成像主要是采用生物發(fā)光和熒光2種技術(shù)。雙光子使用紅外波段的超快激光作為光源，利用光學(xué)非線性效應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的三維、四維甚至實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)[48]。由于紅外光對(duì)生物組織的殺傷作用相對(duì)較小，因此研究者可利用此技術(shù)對(duì)生物樣品進(jìn)行活體動(dòng)態(tài)觀察。同時(shí)，由于長(zhǎng)波長(zhǎng)的長(zhǎng)激光在組織中具有很高的穿透深度[49]，雙光子顯微鏡自誕生以來(lái)是目前應(yīng)用最廣泛的活體腦光學(xué)成像方法[50]。對(duì)于血管相關(guān)疾病和癌癥的研究和治療學(xué)，非常需要在顱內(nèi)發(fā)展穿透深度深和高信噪比的體內(nèi)熒光成像，以觀察血管內(nèi)形態(tài)和血流動(dòng)力學(xué)[51]。在中醫(yī)藥領(lǐng)域，雙光子顯微鏡已有血管疾病和神經(jīng)疾病的相關(guān)應(yīng)用。

譚莉萍等[52]制備大鼠急性血瘀模型后，采用雙光子活體成像技術(shù)，對(duì)小鼠腦血管閉塞-溶栓過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，并觀察血液流變學(xué)及凝血功能等指標(biāo)。結(jié)果顯示銀杏葉提取物在血液流變性、凝血功能、血管內(nèi)皮功能、炎性反應(yīng)應(yīng)答及氧化應(yīng)激等方面具有調(diào)控作用，能夠促進(jìn)腦部微血管栓塞部位的血液流動(dòng)，加快栓塊溶解。提示銀杏葉提取物可有效防治腦部和周圍血流循環(huán)障礙。在同樣中醫(yī)藥治療大腦血管疾病的研究中，Shen Liu等[53]通過(guò)制備永久性局灶性中動(dòng)脈阻斷腦缺血模型（pMCAO），在雙光子顯微鏡下觀測(cè)微血管結(jié)構(gòu)和腦內(nèi)微循環(huán)。結(jié)果顯示在小鼠大腦中動(dòng)脈永久阻斷后6或24 h，通心絡(luò)膠囊可改善神經(jīng)功能缺損，減少梗死面積，減弱血腦屏障破壞，保護(hù)微血管結(jié)構(gòu)，增加毛細(xì)血管流速和體積流量，抑制白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，且治療效果呈劑量依賴性。同樣，另一研究在雙光子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)血栓通可以提高APP/PS1小鼠的腦血流量，且淀粉樣的斑塊減小。這表明相關(guān)中醫(yī)藥有望成為治療阿爾茲海默癥的有效方案[54]。在針灸相關(guān)的研究中，Geng Li等[55]在小鼠后肢肌肉中轉(zhuǎn)染GCaMP2 cDNA 2周后，在麻醉狀態(tài)下固定小鼠之后針刺足三里，通過(guò)雙光子顯微鏡檢測(cè)Ca2+水平。結(jié)果顯示由針刺的機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的聲切波可以使小鼠后肢肌肉的Ca2+增加。

3 小結(jié)

雙光子顯微鏡在中醫(yī)藥研究中發(fā)揮巨大的優(yōu)勢(shì)。1）雙光子顯微鏡能夠觀察在使用各類中藥提取物后細(xì)胞甚至亞細(xì)胞水平上的細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、分子相互作用等現(xiàn)象和過(guò)程進(jìn)行直接的成像監(jiān)測(cè)，已用于中藥提取物對(duì)于腫瘤細(xì)胞的作用及其機(jī)制研究。2）因其具有光漂白性和光毒性小的優(yōu)勢(shì)，在各種中藥及方劑研究腎臟、肝臟和腸組織中已得到有效運(yùn)用。3）活體成像方面，中醫(yī)藥研究證明銀杏葉提取物和通心絡(luò)膠囊可以治療血管類疾病;血栓通可以作為治療阿爾茲海默癥的潛在方案;而針灸也被證明可以提高相應(yīng)穴位附近肌肉的Ca2+水平。綜上所述，雙光子顯微鏡作為現(xiàn)代最重要的光學(xué)顯微鏡，已經(jīng)廣泛運(yùn)用到與中醫(yī)藥有關(guān)的細(xì)胞、組織和活體成像研究中。雙光子顯微鏡技術(shù)與中醫(yī)藥研究的結(jié)合，可以為中醫(yī)藥治療疾病提供更科學(xué)直觀的證據(jù)，還可以闡釋更多的中醫(yī)基礎(chǔ)理論，加快中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展的進(jìn)程。

4 討論

雙光子顯微鏡技術(shù)在中醫(yī)藥研究中廣泛應(yīng)用仍然存在很多問(wèn)題。首先，現(xiàn)在的中醫(yī)藥研究都是基于染料、病毒等熒光標(biāo)記技術(shù)上進(jìn)行，但是這種方法有漂白性大、后期成像不穩(wěn)定等缺點(diǎn);其次，目前其應(yīng)用于中醫(yī)藥的研究多是細(xì)胞及組織層面，在體成像和針灸的研究較少;最后，目前運(yùn)用的多是傳統(tǒng)的體積較大的雙光子顯微鏡，微型雙光子還未用到社會(huì)行為和自然行為的研究中。在今后的中醫(yī)藥研究中，使用攜帶特異性啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因鼠[56-57]將成為雙光子顯微鏡在中醫(yī)藥研究的助力工具。此外，中醫(yī)藥研究還可以拓展針灸在體成像方面的研究，并且結(jié)合光遺傳、化學(xué)遺傳的技術(shù)研究中醫(yī)藥對(duì)神經(jīng)元或者膠質(zhì)細(xì)胞等神經(jīng)細(xì)胞的作用，以及和學(xué)習(xí)、記憶等重要神經(jīng)環(huán)路中的關(guān)系。應(yīng)用微型雙光子顯微鏡還可以對(duì)活動(dòng)范圍廣泛的自由移動(dòng)動(dòng)物的體細(xì)胞以及神經(jīng)元的樹突和棘突中的活動(dòng)進(jìn)行成像，讓小鼠在沒(méi)有情緒和壓力的情況下進(jìn)行使用皮內(nèi)針等特殊針具干預(yù)，為中醫(yī)藥治療情緒疾病和社會(huì)行為缺陷等情緒疾病提供新思路和新方案。綜上所述，結(jié)合現(xiàn)代最新技術(shù)闡釋傳統(tǒng)中醫(yī)基礎(chǔ)理論和中藥、方劑、針灸等治療疾病的機(jī)制依舊是中醫(yī)藥領(lǐng)域的研究關(guān)鍵，可以為中醫(yī)藥治療疾病提供新視角，推動(dòng)中醫(yī)藥現(xiàn)代化的發(fā)展。

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（2020-05-10收稿 責(zé)任編輯：徐穎）