楊 梅

（上海天祥質(zhì)量技術(shù)服務(wù)有限公司食品部，上海 200233）

春雷霉素（kasugamycin），又名春日霉素、加收米、加瑞農(nóng)等，是一種農(nóng)用抗生素類殺菌劑，具有極強(qiáng)的內(nèi)吸滲透性，對(duì)真菌和細(xì)菌都有很好的預(yù)防和治療效果。自研發(fā)以來，其在亞洲和南美洲就被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)，對(duì)水稻稻瘟病、番茄葉霉病、馬鈴薯環(huán)腐病、黃瓜和西瓜細(xì)菌性角斑病等具有很好的防治效果。春雷霉素對(duì)人畜無毒、低殘留、無污染，符合現(xiàn)代化環(huán)保要求[1]，是目前應(yīng)用較為普遍的一種理想殺菌劑。

目前，國內(nèi)的農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》對(duì)春雷霉素的殘留限量有了明確的規(guī)定。該標(biāo)準(zhǔn)已于2020年2月正式生效，標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定春雷霉素在番茄中的最大臨時(shí)限量為0.05 mg/kg[2]。春雷霉素為易溶于水的強(qiáng)極性物質(zhì)，在液相色譜上保留時(shí)間較短，使得對(duì)其的分離和分析有一定難度[3]。目前春雷霉素的檢測方法尚沒有相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，相關(guān)文獻(xiàn)也較少[4-6]，有關(guān)番茄中春雷霉素的殘留檢測方法也很少。筆者通過優(yōu)化色譜、質(zhì)譜條件，建立了用固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定番茄中春雷霉素的方法，供相關(guān)人員測定番茄中春雷霉素殘留時(shí)做參考。

1 實(shí)驗(yàn)器材與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀、HILIC色譜柱（150 mm×3.0 mm），賽默飛世爾科技（中國）有限公司；BH600分析天平，梅特勒-托利多（上海）有限公司；攪拌機(jī)，飛利浦（中國）投資有限公司；SF-DL-4M冷凍離心機(jī)，上海菲恰爾分析儀器有限公司；SK3300HP超聲波提取儀，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；DC-12H氮吹儀，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；渦旋混合器，上海醫(yī)大儀器有限公司；FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī)，上海標(biāo)本模型廠；57044固相萃取儀，美國色譜科公司。

1.1.2 試劑和耗材

超純水，美國密里博公司；乙腈（色譜級(jí)）、甲醇（色譜級(jí)）、甲酸（色譜級(jí)），美國ACS恩科化學(xué)有限公司；氨水（分析純），上海國藥集團(tuán)；PCX混合陽離子交換固相萃取柱（60 mg/3 mL），天津博納艾杰爾科技有限公司；高純度氮?dú)猓兌?9%）、高純度氬氣（純度99%），上海液化空氣集團(tuán)。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

春雷霉素鹽酸鹽（kasugamycin hydrochloride），CAS為19408-46-9，分子式為C14H26ClN3O9，分子量為415.824。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購自Dr.E.公司。

1.1.4 試劑的配置

①10%氨水-甲醇溶液：移取10 mL氨水用甲醇定容至100 mL；②0.1%甲酸-水溶液：移取1 mL甲酸用水定容至1 000 mL。

1.1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

①標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 000 mg/L）：精確稱取10.95 mg春雷霉素鹽酸鹽（折算后含純品春雷霉素10 mg）標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并定容至10 mL，使其標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中春雷霉素的質(zhì)量濃度為1 000 mg/L。置于1～4℃冰箱保存，可保存12個(gè)月。②標(biāo)準(zhǔn)中間液（10.00 mg/L）：準(zhǔn)確移取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液100 μL用水定容至10 mL，混勻。置于1～4℃冰箱保存，可保存1個(gè)月。

1.2 試樣的制備與保存

抽取番茄樣品，先用攪拌機(jī)攪碎，再用高速分散均質(zhì)器以15 000 r/min轉(zhuǎn)速進(jìn)一步勻漿至糊狀，于4℃保存，待測。

1.3 試樣的前處理

1.3.1 提取

稱取均質(zhì)后試樣2.00 g于50 mL離心管中，加入10 mL水，渦旋均勻，超聲15 min，以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，用水定容至20 mL。

1.3.2 凈化

取10 mL提取液過用6 mL甲醇、6 mL水活化好的PCX混合陰離子交換固相萃取柱。隨后用3 mL水、3 mL甲醇淋洗，抽干。用10%氨水-甲醇9 mL洗脫：用甲醇定容至10 mL；取2 mL氮吹去除氨水，至約0.5 mL；用50%甲醇水溶液定容至2 mL，過膜后上機(jī)進(jìn)行LC-MS/MS檢測。

1.4 儀器條件

①液相條件。色譜柱：HILIC柱（150 mm×3.0 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為乙腈，流動(dòng)相梯度見表1；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 流動(dòng)相梯度

②質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧ESI離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：SRM；電噴霧電壓：3 500 V；鞘氣：高純氮?dú)猓? psi；輔助氣：高純氬氣，5 psi。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的確定

春雷霉素在C18液相色譜柱上沒有保留，本方法采用HILIC柱進(jìn)行色譜分析。采用乙腈和0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相。

在全掃描方式下，配置一定濃度標(biāo)準(zhǔn)品，將標(biāo)準(zhǔn)品直接注入質(zhì)譜來優(yōu)化質(zhì)譜條件，找到最強(qiáng)的+H離子峰作為母離子，對(duì)選定的母離子進(jìn)行掃描，優(yōu)化碰撞能，選擇其中響應(yīng)和峰型較好的2對(duì)離子對(duì)作為定量離子（380.2/112.0）和定性離子（380.2/336.1）。碰撞能量（V）為17/5，傳輸透鏡補(bǔ)償電壓為74 V。春雷霉素標(biāo)準(zhǔn)品的多反應(yīng)監(jiān)測模式離子掃描譜見圖1。

圖1 春雷霉素的標(biāo)準(zhǔn)品多反應(yīng)監(jiān)測模式離子描譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

為消除LC-MS/MS的基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測結(jié)果造成的影響，筆者以空白番茄提取液作為溶劑配置并繪制春雷霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的基質(zhì)工作曲線，質(zhì)量濃度點(diǎn)分別為5、10、20、50、100 μg/L，利用MRM離子掃描方法進(jìn)行檢測，得到春雷霉素標(biāo)曲線的回歸方程，線相關(guān)系數(shù)為0.999 7，在5～100 μg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，適合做定量分析。春雷霉素的基質(zhì)工作曲線見圖2。

圖2 春雷霉素的基質(zhì)工作曲線

2.3 方法的準(zhǔn)確度和精密度

按照已建立的方法，以番茄為空白，按照0.05、0.10、0.20 mg/kg的加標(biāo)量對(duì)春雷霉素進(jìn)行添加實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平進(jìn)行7次平行試驗(yàn)，檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度和精密度?；厥章蕿?5.25%～85.74%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.51%～3.80%。各組分的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表2。春雷霉素樣品加標(biāo)多反應(yīng)監(jiān)測模式離子掃描譜圖見圖3。

2.4 實(shí)際樣品的測定

利用所建立的方法分析了從上海某市場及超市中采集的番茄樣品中的春雷霉素，在少數(shù)的番茄樣品中檢測到微量春雷霉素殘留，但未達(dá)到方法檢出限。圖4是某市場采集的番茄樣品的多反應(yīng)監(jiān)測模式正離子掃描譜圖。

表2 春雷霉素的加標(biāo)量、加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

圖3 春雷霉素的樣品加標(biāo)多反應(yīng)監(jiān)測模式正離子掃描譜圖

圖4 實(shí)際樣品的多反應(yīng)監(jiān)測模式正離子掃描譜圖

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用水溶液為提取溶劑，將固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)相結(jié)合，建立了測定番茄中春雷霉素殘留量的分析方法。該方法操作簡單、快速，靈敏度，準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定性好，污染小，檢出限能夠滿足相關(guān)殘留限值的要求。利用該方法能夠?qū)崿F(xiàn)番茄中春雷霉素殘留量的檢測。