王杰，董弘，武麗瓊，郭志遠，安槿，張麗春，徐睿廷，王曉華，賈躍旗

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院a.遺傳優(yōu)生科，b.超聲醫(yī)學(xué)科，呼和浩特010020；2.內(nèi)蒙古大學(xué)省部共建草原家畜生殖調(diào)控與繁育國家重點實驗室，呼和浩特 010021)

1997年盧煜明等[1]發(fā)現(xiàn)母體血漿中存在胎兒游離DNA(cffDNA)，為胎兒染色體非整倍體的無創(chuàng)產(chǎn)前篩查(non-invasive prenatal screening, NIPS)開辟了新的方向。與傳統(tǒng)的產(chǎn)前篩查相比，NIPS具有更高的敏感性和特異性。一項薈萃(meta)分析結(jié)果表明，NIPS對于T21、T18和T13的檢出率分別為99.0%、96.80%和92.1%，假陽性率分別為0.08%、0.15%和 0.2%[2]。另有研究發(fā)現(xiàn)，部分假陰性結(jié)果與低胎兒濃度和嵌合體有關(guān)，但也有一些病例尚未得到解釋[3]。由于假陰性更容易引起臨床誤診，因此研究假陰性的原因具有重要的臨床意義。

本研究對3例經(jīng)NIPS檢測結(jié)果為低風險，后經(jīng)產(chǎn)前及產(chǎn)后跟蹤分析診斷為假陰性的病例進行回顧性分析及進一步的檢測，評估NIPS發(fā)生假陰性的影響因素，并對比不同測序平臺及加大測序深度后對假陰性樣本的檢出效果，總結(jié)NIPS在臨床應(yīng)用中的局限性，為檢測低風險孕婦的遺傳咨詢和臨床管理提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集2018年7月至2019年7月在內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院行NIPS檢測提示為低風險的19 242例孕婦，年齡18～47歲，中位年齡32歲，孕周12～37周，平均孕周19周；所有孕婦在1年之內(nèi)無輸血、移植、免疫治療等異體細胞輸入史。后經(jīng)本院遺傳優(yōu)生科產(chǎn)前及產(chǎn)后染色體核型分析診斷為假陰性病例3例。本研究經(jīng)內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院倫理委員會審核批準(No.2019-007-1)，所有研究對象均知情同意。

1.2主要儀器及試劑 Sorvall ST16R 冷凍離心機、Qubit3.0熒光定量儀、Ion Proton高通量測序儀(美國Thermo Fisher公司)，GSL-120全自動染色體核型分析系統(tǒng)(德國Laica公司)，Agena MassARRAY飛行時間質(zhì)譜、COMPLETE GENOTYPING REAGENT SET檢測試劑盒(美國Agena公司)，QIAamp DNA Blood Mini Kit(德國Qiagen公司)，胎兒染色體非整倍體21三體、18三體和13三體檢測試劑盒(半導(dǎo)體測序法，中山大學(xué)達安基因公司)，MGISEQ-500測序儀、胎兒染色體非整倍體(T21、T18、T13)檢測試劑盒(聯(lián)合探針錨定聚合測序法)、染色體拷貝數(shù)變異(copy number variations,CNVs)檢測試劑盒、測序反應(yīng)通用試劑盒(聯(lián)合探針錨定聚合測序法)均購自武漢華大基因科技公司，真空采血管(北京康為世紀公司)。

1.3妊娠管理 NIPS檢測為低風險的孕婦經(jīng)遺傳咨詢并進行孕期超聲跟蹤，如胎兒超聲檢查提示異常人群，于孕18～22周借助于羊膜腔穿刺技術(shù)獲得羊水細胞進行染色體核型分析，>23周者用臍靜脈穿刺技術(shù)采集臍帶血進行染色體核型分析。孕期無異常者持續(xù)跟蹤至胎兒出生，如發(fā)現(xiàn)特殊面容或符合T21、T18或T13超聲異常指征的新生兒，采集外周血進行染色體核型分析檢測，并對其孕期影像學(xué)檢測結(jié)果進行回顧性分析。

1.4假陰性樣本的實驗室質(zhì)量控制

1.4.1樣本混樣排查 對樣本送檢單、知情同意書、檢測過程的原始記錄及質(zhì)控記錄進行整體回顧，核對送檢單上樣本編號、姓名的一致性，同時回顧同批次送檢樣本檢測結(jié)果，評估混樣可能。使用備份白細胞樣本、備份血漿文庫進行質(zhì)譜檢測，評估檢測樣本與備份白細胞樣本的一致性。

1.4.2備份樣本復(fù)測 啟用備份血漿采用相同的方法進行二次復(fù)測，評估2次檢測結(jié)果的一致性；更換不同檢測試劑盒，使用Ion Torrent半導(dǎo)體測序平臺進行檢測，評估檢測方法、測序儀、數(shù)據(jù)算法的一致性；使用擴展性無創(chuàng)產(chǎn)前篩查(NIPS-Plus)增加測序量(有效數(shù)據(jù)量≥25 M)、提高測序深度、優(yōu)化算法評估檢測結(jié)果的一致性。

1.4.3母體背景排查 使用備份母體白細胞進行染色體微缺失微重復(fù)檢測(CNV-Seq)，排查母體存在微缺失或微重復(fù)對檢測結(jié)果的影響。

1.4.4胎盤嵌合排查 采集假陰性病例胎盤樣本，提取基因組DNA進行CNV-Seq，對胎盤組織中染色體情況進行排查。

1.5NIPS(Complete Genomics測序平臺) 空腹抽取孕婦孕期外周靜脈血5 mL，置于游離DNA專用真空采血管(EDTA-K2抗凝)中，按照本實驗室建立的NIPS標準化操作方法[4]進行，經(jīng)4 ℃、1 600×g離心10 min，取上清液，16 000×g離心10 min去沉淀，收集血漿置于-20 ℃暫存，后轉(zhuǎn)入-80 ℃長期保存。應(yīng)用聯(lián)合探針錨定聚合測序法，按照胎兒染色體非整倍體(T21、T18、T13)檢測試劑盒說明書操作，并借助于BGI500測序平臺進行測序，利用高分辨率成像系統(tǒng)及生物信息系統(tǒng)轉(zhuǎn)換得到待測序列。所得序列經(jīng)與人參考基因組(如GRCh37/hg19)比對，確定每一測序reads染色體的定位，計算得出標準化Z值。綜合運用Y染色體估算法和seqFF估算法，評估樣本中胎兒游離DNA比例[5]。當樣本滿足度量標準(有效數(shù)據(jù)量≥3.5 M，無擴增偏倚，cffDNA比例≥3.5%)時根據(jù)標準化Z值評估檢測結(jié)果，若Z值的絕對值≥3，提示高風險；Z值介于±3之間，結(jié)果為低風險。

1.6NIPS (Ion Torrent半導(dǎo)體測序平臺) 根據(jù)標準規(guī)范及本實驗室標準化Ion Torrent半導(dǎo)體測序平臺規(guī)程[4]進行操作，獲得定量后的文庫，單個樣本終濃度為100 pmol/L，獲得pooling文庫，再經(jīng)過乳液PCR擴增并上機測序，獲得原始數(shù)據(jù)。經(jīng)數(shù)據(jù)分析后得出最終標準化Z值，采用DNA片段大小估算胎兒DNA濃度[6]，當樣本滿足度量標準(有效數(shù)據(jù)量≥3.0 M，無擴增偏倚，cffDNA比例≥5%)，根據(jù)標準化Z值評估檢測結(jié)果，若Z值的絕對值≥3，提示高風險；Z值介于±3之間，結(jié)果為低風險。

1.7NIPS-Plus檢測 按照胎兒染色體非整倍體(T21、T18、T13)檢測試劑盒(聯(lián)合探針錨定聚合測序法)說明書操作，采用BGI500測序平臺進行測序，通過高分辨率成像系統(tǒng)采集光信號，光信號經(jīng)過數(shù)字化處理后，使用RUPA算法將原始reads比對至hg19/GRCh37參考基因組，經(jīng)數(shù)據(jù)分析后得出最終標準化Z值，樣本滿足度量標準(有效數(shù)據(jù)量≥25 M，無擴增偏倚，cffDNA比例≥3.5%)。根據(jù)標準化Z值評估檢測結(jié)果，若Z值的絕對值≥3，提示高風險；Z值介于±3之間，結(jié)果為低風險。

1.8臍靜脈穿刺與外周血染色體核型分析 在超聲引導(dǎo)下無菌采集>23周的孕婦臍帶血2 mL(肝素抗凝)，采集新生兒靜脈血2 mL(肝素抗凝)。根據(jù)標準規(guī)范及本實驗室標準化臍帶血/外周血培養(yǎng)規(guī)程[7]進行操作，使用Trypsin-Giemsa染色法制備染色體G帶。Leica GSL-120全自動掃描顯微鏡和圖像分析系統(tǒng)觀察高倍顯微鏡下每份樣品至少50個中期相(400～500帶分辨率水平)，如果有嵌合現(xiàn)象，增加計數(shù)分裂相至100個。根據(jù)人類細胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN)2016版標準進行核型分析診斷，核型評估工作由2名有資質(zhì)的高級實驗室人員獨立完成。

1.9拷貝數(shù)變異(copy number variations,CNVs)檢測 按照QIAamp DNA Blood Mini Kit說明書提取基因組DNA。采用Nanodrop 2000微量紫外分光光度計測定吸光度(A260/280 nm)值，計算DNA濃度及純度，取A260/280 nm比值為1.8～2.0的樣本用于后續(xù)試驗。將50 ng DNA切割成300 bp大小的片段，通過末端標記法、接頭連接和PCR擴增的方式建立DNA文庫。使用BGISEQ-500測序平臺進行大規(guī)模平行測序，生成35 M有效數(shù)據(jù)量。

應(yīng)用Burrows-Wheeler算法，以hg19基因組序列為參照，唯一比對到基因組的序列數(shù)據(jù)量為2.8～3.2 M。根據(jù)Decipher、DGV、千人基因組以及OMIM等公共數(shù)據(jù)庫對CNV進行查詢，然后根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)會(The American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)2015年指南[8]對其致病性進行評估解讀。變異被劃分為致病、可能致病、致病性未知(VUS)、可能良性或良性。

1.10飛行時間質(zhì)譜檢測 使用Agena MassARRAY飛行時間質(zhì)譜對母體白細胞及備份血漿文庫進行34個單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(rs9951171、rs987640、rs985492、rs891700、rs7520386、rs740598、rs722290、rs6444724、rs590162、rs560681、rs521861、rs4789798、rs3780962、rs321198、rs2833736、rs2831700、rs2830795、rs2811231、rs279844、rs2567608、rs2291395、rs214955、rs1872575、rs1736442、rs1554472、rs1523537、rs1498553、rs1478829、rs13218440、rs13182883、rs1109037、rs10768550、rs1031825、rs1004357)的比對，以排除混樣可能。如果樣本之間有≤3個位點不符合，則判斷來源于同一個樣本的可能性大；如果樣本之間有>3個位點不符合，則判斷混樣可能性大。

2 結(jié)果

2.13例孕婦、新生兒檢測結(jié)果與干預(yù)措施 孕婦1：34歲，孕3產(chǎn)1，孕12+1周超聲篩查提示胎兒頸后透明帶厚度2.6 mm；孕13周血清學(xué)篩查結(jié)果提示21三體綜合征臨界風險，風險值1/766；孕14+6周NIPS檢測結(jié)果提示低風險，胎兒濃度4.016%，體質(zhì)指數(shù)(BMI)=24.74；隨訪至孕19+1周，超聲提示胎兒雙側(cè)脈絡(luò)叢囊腫(左側(cè)1.3 cm×0.7 cm；右側(cè)1.2 cm×0.8 cm)，單臍動脈；孕22+1周，胎兒雙頂徑5.6 cm，心臟聲像改變，右室雙出口(SDS)主動脈瓣下室缺，完全型房室間隔缺損，后顱窩池增寬，雙手疑似重疊指。經(jīng)臍靜脈穿刺核型分析檢測結(jié)果為47,XN,+18(圖1A)，后終止妊娠。

孕婦2：38歲，孕2產(chǎn)1，未進行孕早期胎兒頸項透明層(NT)檢測，未行血清學(xué)篩查檢測；孕16+1周、孕21+2周超聲檢測未發(fā)現(xiàn)胎兒明顯異常；孕22+5周NIPS檢測結(jié)果提示低風險，胎兒濃度6.129%，BMI=24.60。于孕38+6周足月剖宮產(chǎn)1女，Apgar評分9分，精神反應(yīng)較好，面容表現(xiàn)為眼距寬、低耳位、頸蹼，左右手通貫掌，小指雙指節(jié)。超聲結(jié)果提示動脈導(dǎo)管未閉，房間隔多發(fā)小缺損，卵圓孔未閉，三尖瓣中量反流，二尖瓣少量反流，肺動脈高壓。經(jīng)外周血染色體核型分析檢測后結(jié)果為47，XN，+21(圖1B)。

孕婦3：29歲，孕2產(chǎn)1，血清學(xué)篩查結(jié)果為低風險，孕期超聲提示單臍動脈，孕21周NIPS檢測結(jié)果為低風險，胎兒濃度21.686%，BMI=20.70。新生兒出生后外周血染色體核型分析檢測結(jié)果為47，XN，+21(圖1C)。

2.2實驗室質(zhì)量控制排查結(jié)果 3例NIPS假陰性樣本經(jīng)核對，樣本檢測過程未見異常。經(jīng)飛行時間質(zhì)譜檢測比對的母親白細胞與文庫DNA的34個SNP位點，判斷為3例樣本文庫和白細胞來源一致，未發(fā)生標本混樣。

2.3NIPS復(fù)測結(jié)果

2.3.1Complete Genomics與Ion Torrent半導(dǎo)體測序平臺NIPS檢測結(jié)果 3例樣本經(jīng)取備份血漿樣本分別使用Complete Genomics NIPS復(fù)測、半導(dǎo)體測序平臺NIPS檢測后，檢測結(jié)果與Complete Genomics首次檢測結(jié)果一致，均為低風險(表1)。相應(yīng)CNVs圖示未見異常。

表1 Complete Genomics與Ion Torrent半導(dǎo)體測序平臺NIPS檢測結(jié)果

2.3.2Complete Genomics測序平臺NIPS與NIPS-Plus檢測結(jié)果 3例血漿樣本分別進行NIPT-Plus檢測，檢測結(jié)果與NIPS首次檢測及復(fù)測結(jié)果一致，均為低風險(表2)。Complete Genomics測序平臺進行的3次測序均未發(fā)現(xiàn)CNVs。

表2 Complete Genomics測序平臺NIPS與NIPS-Plus檢測結(jié)果

2.4母體白細胞及胎盤樣本CNVs檢測結(jié)果 3例樣本使用孕婦孕期備份白細胞樣本進行CNVs檢測，未發(fā)現(xiàn)有1 M以上的缺失/重復(fù)。獲取樣本2胎盤膠囊制品(4粒)，經(jīng)CNVs檢測提示胎盤樣本存在chr21三體嵌合，異常比例分別為25%、25%、25%、24%。見圖2。未能取得樣本1和樣本3的胎盤樣本。

3 討論

近年來，NIPS與侵入性產(chǎn)前診斷結(jié)果不符的情況時有報道，目前認為與生物學(xué)有關(guān)的假陽性因素主要包括CNVs、母體嵌合(maternal mosaicism)、限制性胎盤嵌合體(confined placental mosaicism，CPM)、雙胎消失綜合征(the vanishing twin syndrome)和孕婦患有惡性腫瘤[9]。相反，DNA濃度過低、嵌合體、胎兒細胞和染色體異常而胎盤染色體正常、母體CNVs、檢測Z值的統(tǒng)計學(xué)波動是可能造成假陰性的主要原因[10]。但是對于增加測序深度及更換不同測序平臺是否會對檢測效果出現(xiàn)影響目前尚未見報道。本研究中3例NIPS假陰性樣本首先經(jīng)飛行時間質(zhì)譜檢測發(fā)現(xiàn)樣本文庫和白細胞來源一致，未發(fā)生標本混樣。

本研究中3例NIPS假陰性病例通過使用Ion Torrent半導(dǎo)體測序平臺復(fù)測，結(jié)果仍為低風險，表明使用不同測序平臺對于避免假陰性結(jié)果作用有限。近幾年發(fā)展起來的NIPS-Plus技術(shù)將有效數(shù)據(jù)量提升至≥25 M，進一步優(yōu)化算法，以實現(xiàn)對更多染色體微缺失微重復(fù)的檢測。本研究對3例假陰性樣本使用NIPS-Plus技術(shù)檢測，結(jié)果顯示增加測序深度后未能避免假陰性的發(fā)生。孕婦血漿中胎兒DNA含量是影響NIPS準確性的重要參數(shù)，胎兒DNA含量較低的樣本中可能會出現(xiàn)假陰性結(jié)果[6]。對樣本1、樣本2檢測結(jié)果進一步分析，發(fā)現(xiàn)胎兒DNA含量均偏低(小于10%)。對樣本2采集到的胎盤膠囊制品檢測，提示存在24%～25%的21三體嵌合，且其胎兒濃度為6.129%，導(dǎo)致用于21三體檢測的有效胎兒分數(shù)減少(<2.2%)，低于NIPS方法的檢測閾值(3.5%)[11]。目前對于使用不同檢測平臺對比的研究較少，在本研究中不同檢測平臺(Complete Genomics測序平臺/Ion Torrent半導(dǎo)體測序平臺)使用相應(yīng)DNA濃度算法未能避免該假陰性的發(fā)生。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，NIPS可檢出異常細胞的嵌合率為29%以上的18和21三體嵌合樣本，但10%以下嵌合或低胎兒游離DNA濃度會導(dǎo)致假陰性結(jié)果[12]。綜合上述因素，考慮胎兒濃度與嵌合率均偏低是導(dǎo)致樣本2假陰性的原因。

本研究的局限性在于樣本量偏少，且未能取得樣本1和樣本3的胎盤樣本，無法排除限制性胎盤嵌合的可能性?？紤]到樣本1的cffDNA濃度較低，推測可能是造成NIPS檢測假陰性的一個重要因素。但樣本3在cffDNA濃度比例較高的情況下，依舊出現(xiàn)檢測假陰性，可能存在更多的未知原因。這提示在臨床中對NIPS檢測結(jié)果進行咨詢的時候，需要適當考慮cffDNA濃度因素。對于NIPS低風險病例，應(yīng)超聲定期隨訪，如發(fā)現(xiàn)超聲持續(xù)異常，建議進一步遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷，在一定程度上能避免有明顯畸形的NIPS假陰性胎兒的出生。同時有效保存孕婦生產(chǎn)后胎盤樣本將有助于更好地分析判斷假陰性出現(xiàn)的原因。